题目苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用

2013届本科生毕业论文（设计）题目苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用作者姓名电帅指导教师吴元明二级学院医学院专业药学学号9B093139苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用摘要本研究采用聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序方法对一个确诊的苯丙酮尿症（PKU）家系的苯丙氨酸羟化酶（PAH）及6-丙酮酰四氢蝶吟合成酶（PTPS）的基因序列热点突变位点及分布特征进行研究，优化了苯丙酮尿症致病基因检测方法。结果表明：家系中父亲和母亲是苯丙酮尿症致病基因PAH的突变携带者,儿子同时遗传了父亲和母亲的突变基因，导致其患病，是典型的PKU家系，本研究为苯丙酮尿症患者产前诊断、治疗、遗传咨询、优生优育奠定基础有重要意义。关键词：PKU；PAH；PTPS；突变热点Phenylketonuriapathogenicgenedetectionmethodoptimization

andapplicationAbstractThroughthepolymerasechainreaction(PCR)amplificationandsequencing，thisresearchdiscussedhotspotmutationsitesanddistributioncharacteristicsofthephenylalaninehydroxylase(PAH)and6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase(PTPS)genesinthephenylketonuria(PKU)family.Theresearchoptimizedthedetectionmethodsofphenylketonuriadiseasegenes.TheresultsshowedthatthemotherandfatherinthefamilywerethecarriersofPAHgene.Becauseofinheritingthegenesofthefatherandmotheratthesametime,thesonleadedtothePKU.Forphenylketonuriaprenataldiagnosis,therapy,geneticcounseling,prenatalandpostnatalcareofpatients,thestudylaidthefoundationforanimportantsignificance.Keywords:PKU;PAH;PTPS;Mutation目录TOC\o"1-5"\h\z引言 -1-\o"CurrentDocument"1实验材料 -3-样本来源 -3 -\o"CurrentDocument"主要试剂 -3-\o"CurrentDocument"1.3主要仪器 -3-\o"CurrentDocument"实验方法 -4-\o"CurrentDocument"2.1DNA提取 -4-\o"CurrentDocument"2.2PCR扩增 -4-\o"CurrentDocument"2.2.1PCR反应体系 -4-\o"CurrentDocument"2.2.2反应条件 -4-\o"CurrentDocument"2.3琼脂糖凝胶电泳 -5-2.3.1琼脂糖凝胶的制备 -5-2.3.2胶板的制备 -5-\o"CurrentDocument"加样 -5-\o"CurrentDocument"电泳 -6-\o"CurrentDocument"观察 -6-测序 -6 -\o"CurrentDocument"统计学分析 -6 -\o"CurrentDocument"实验结果 -6-\o"CurrentDocument"4讨论 -8-结论 -9-参考文献 - 10-致 谢 -12-附 录 -13-引言苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种氨基酸代谢异常的遗传病。因其致病基因在常染色体上，所以发病几率和性别无关［1］。根据发病机制不同，学者把苯丙酮尿症分为两个类型，一类是典型 PKU，病因是苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突变导致苯丙氨酸羟化酶缺乏所致，占全部疾病的98%〜99%；另一类是四氢生物喋吟缺乏症(tetrahydrobiopterindeficiency，BH4D)，病因是苯丙氨酸羟化酶的辅酶，四氢生物喋吟(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏所致，占1%〜2%。PKU的主要临床表现为，皮肤色浅、头发细黄、虹膜淡黄色，同时尿有“发霉”臭味或鼠尿味，智力低下；而且60%患儿有脑电图异常和继发性癫痫［2］，严重者甚至可能导致死亡［3］。苯丙酮尿症在全世界有广泛的发病几率，但也因地区及种族有明显差异，发病率总体约为1：500－1：10000［4］。有文献报道，苯丙酮尿症发病率白种人大于黑种人和黄色人种。其中Turkey1：2600［5］、USA约为1：14000、theNorthernIsland约为1：4400、Germany约为1：7000、Japan约为1：78400［6］。根据国家新生儿筛查中心(Newbornscreening，NBS)提供数据显示，我国新生儿苯丙酮尿症发病率为1/11572［7］。而陕西省2004年－2009年的新生儿的苯丙酮尿症发病率高达1/3425。也有文献报道我国PKU发病存在着北方高于南方，东部地区低于中部和西部地区的特点［8］。苯丙酮尿症作为可治疗的遗传代谢性疾病之一，若能达到早诊断、早治疗，就能有效地控制该病的发生与发展，最大限度地减少社会和家庭的负担，为提高我省人口素质具有一定意义。PKU的致病基因的发现可以追溯到1983年，苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因被成功分离、克隆⑼。苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因位于常染色体12q24.1,大约由1.5Mb碱基组成。PAH基因是割裂基因，编码区包含13exons，同时被12introns所分隔。转录时剪接intron形成仅包含exon的1353bp的单链，即包含451密码子的可译框。信使核糖核酸(mRNA)翻译成含451氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的PAH酶［10,11］。截至2011.5月，国内外已发现PAH基因的564种突变(http://www.mcgill.ca/pahdb)oPAH基因的突变大部分位于编码区的基因的突变，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置，根据对苯丙氨酸羟化酶酶活性有无影响，突变又可分为致病突变和沉默突变。致病突变大多位于exon上，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。沉默突变对苯丙氨酸羟化酶活性无影响。苯丙酮尿症中5种重要的酶参与辅酶四氢生物喋呤的合成或代谢循环，可以说其中任何一种酶基因的缺陷均可导致BH4缺乏型PKU（即非经典型苯酮尿症,也称恶性苯酮尿症）。BH4是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等三种芳香族氨基酸羟化酶作用所必需的辅助因子，而6-丙酮酰四氢喋吟合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase,PTPS）是合成BH4的关键酶之一，其缺陷是BH4缺乏型PKU的最常见病因。尽管经典PKU总发病率低于西方人，但有调查表明我国汉族人群BH4缺乏型PKU较西方人为多［12］。追溯到1986年就有通过生化手段进行BH4缺乏型PKU的产前诊断的报道，但因羊水中的生物蝶吟极不稳定,PTPS酶学分析方法较复杂而使其应用受到限制［13-15］,6-丙酮酰四氢喋吟合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase,PTPS）是BH4合成必需的催化酶，PTPS缺乏是导致BH4D的最主要原因。PTPS全长约9kb,共有6个exon，编码145个氨基酸，已报道的突变主要分布在exon2、5、6。苯丙酮尿症致病基因苯丙氨酸羟化酶和6-丙酮酰四氢喋吟合成酶基因突变具有以下特点：（1）突变位置多变：所有exon、intron、5,-UTR和3,-UTR区均发现突变。（2）突变类型多样：有错义突变（60.08%）、小缺失突变（13.35%）、剪接位点突变（11.03%）、沉默突变（7%）、无义突变（4.98%）、小插入（1%）、大片段插入罕见（＜1%）［11］，但大部分是错义突变。（3）突变呈现明显的异质性，不同种族和地区人群之间基因座突变部位及分布具有较大差异。由于苯丙氨酸羟化酶和6-丙酮酰四氢喋吟合成酶基因仅在肝脏和肾脏中表达，故基因诊断是早期苯丙酮尿症诊断的目前最有效的手段。目前国内外对苯丙酮尿症患儿的诊断实验方法主要：Guthrie细菌抑制试验、尿三氯化铁试验、血清苯丙氨酸浓度测定和尿蝶吟分析。这几种生化检测的方法耗时长且繁琐，而且仅适用与已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。尤其对已生育过苯丙酮尿症患儿的家庭，再次怀孕生育苯丙酮尿症患儿的概率为25%的高危家庭，盲目生育导致悲剧发生的可能性极大。现已对PKU患者的筛查和临床检验已经达到基因水平，如单链多态性PCR检测（PCR-SSCP）、等位基因特异性寡核苷酸杂交法

（PCR-ASO）、限制性内切酶的酶切（PCR-RFLP）、等位基因特异性扩增（ARMS）、短串联重复序列（PCR-STR）及高压液相色谱定量（HPLC）法等已经应用于临床，这些实验都为PKU的早期诊断和早期治疗提供检验学依据和基础。本课题采用序列分析的方法，选择一个已出现过PKU患者的陕西家系进行PAH基因和PTPs基因的突变方法的优化和研究，这些不仅有助于深入研究突变发生的分子机制，基因诊断、产前诊断、个性化治疗、新药开发提供重要的参考，并为制定出适合我省PKU患者孕前、产前诊断的最佳诊断筛查方案具有重要意义。实验材料1.1样本来源一个明确诊断的PKU家系:父母非近亲婚配，均表现正常，已育有1子在出生后1月起病，表现为喂养困难、惊厥、全身瘫痪和重度智力损害，且低苯丙氨酸饮食治疗无效。生化检查示患男其血苯丙氨酸〉20mg/dl6。1.2主要试剂1.2主要试剂全血DNA快速抽提试剂盒琼脂糖DNAMarker、dNTPMixture、MgCl2TaqDNA聚合酶、TaqBufferDNAMarker、6"LoadingBufferEB1.3主要仪器德国QIAGEN天津科密欧化学试剂有限公司TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司天津科密欧化学试剂有限公司BECKMANBECKMAN公司BIO-RAD公司Microfuge22R离心机PTC-200PCR仪DYY-7型、DYCZ-20C型电泳槽DYY-12型电泳仪电源北京六一仪器厂实验方法DNA提取(1)取EDTA抗凝血样本300卩1于1.5ml离心管中，在血样品中加入750卩1红细胞裂解液CL充分颠倒混匀，12000rpm离心1min，小心吸去上清，重复以上步骤一次。向沉淀中加入150卩1的FG与1.5卩1蛋白酶K的混合液，迅速吹打混匀混匀，65°C水浴10分钟。加入150卩1异丙醇，充分颠倒混匀(约20次)直至出现白色絮状物。12000rpm离心5min，弃上清液留沉淀。向上一步沉淀中加入700卩1无水乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液。加入200p1TB,65C水浴1小时。所得基因组DNA样品测定分光光度值(OD260/OD280)。用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，-20C保存备用。PCR扩增将提取的DNA分别进行PAH基因第3、5、6、7、11和12exon和PTPS基因第2、5、6exon的PCR扩增。PAH基因exon引物序列参考文献［⑺、PAH基因exon引物序列参考文献［18］,由上海生工生物技术有限公司合成(见表1)。PCR反应体系总体积20吐，其中含10X缓冲液，Mg2+2.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,上下游引物各0.5ymol/L,Taq酶1U,模板1吐。反应条件94C预变性3min；94C30s,退火30s(退火温度见表2-1),72C30s,

35个循环；72°C延伸5min,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。表2-1PKU致病基因exon引物序列基因引物序列 退火温度（C）产物长度（bp）PAH-3FGCCTGCGTTAGTTCCTGTGAPAH-3RCTTATGTTGCAAAATTCCTCPAH-5FTCATGGCTTTAGAGCCCCCAPAH-5RAGGCTAGGGGTGTGTTTTTCPAH-6FCCGACTCCCTCTGCTAACCTPAH-6RCAATCCTCCCCCAACTTTCTPAH-7FTAGCGTCAAAGCCTATGTCCPAH-7RAAACCTCATTCTTGCAGCAGPAH-11FTGAGAGAAGGGGCACAAATGPAH-11RCCACCCACAGATGAGTGGCAPAH-12FTTCTCCAAATGGTGCCCTTCPAH-12RACTGAGAAACCGAGTGGCCTPTPs2FTTCTGACTCTCCCTTTGGTGAGCTPTPs2RGCATTCACACTGTGTCCGTAAGTT6030061基因引物序列 退火温度（C）产物长度（bp）PAH-3FGCCTGCGTTAGTTCCTGTGAPAH-3RCTTATGTTGCAAAATTCCTCPAH-5FTCATGGCTTTAGAGCCCCCAPAH-5RAGGCTAGGGGTGTGTTTTTCPAH-6FCCGACTCCCTCTGCTAACCTPAH-6RCAATCCTCCCCCAACTTTCTPAH-7FTAGCGTCAAAGCCTATGTCCPAH-7RAAACCTCATTCTTGCAGCAGPAH-11FTGAGAGAAGGGGCACAAATGPAH-11RCCACCCACAGATGAGTGGCAPAH-12FTTCTCCAAATGGTGCCCTTCPAH-12RACTGAGAAACCGAGTGGCCTPTPs2FTTCTGACTCTCCCTTTGGTGAGCTPTPs2RGCATTCACACTGTGTCCGTAAGTT60300613546027364357602456227663252PTPs56FTAGTGGCTAAGTGATAAGGTGPTPs56RGAAAATGAAGTGATTTTTAATTTAT61 425PTPs56R2CAATAAATAGGCACTCCAGAGC2.3琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备称取0.5g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入50ml0.5xTBE,置微波炉中加热使其充分溶解，取出摇匀；胶板的制备将有机玻璃底板放入水平放置的制胶塑料模板中，垂直于玻璃板表面插入梳子。待琼脂糖凝胶液冷却到65C左右，加入12.5“lE液（10mg/ml）,将凝胶液缓慢的倒入玻璃底板上，室温下静置30min,直至凝胶完全凝固。小心的将梳子垂直拔出，将胶板置于电泳槽中。2.3.3加样用微量移液器取PCR产物3卩1于干净的塑料膜上，再加入1卩16xLoadingBuffer,用微量移液器吹打混匀，小心缓慢的将样品加入到凝胶点样孔内。2.3.4电泳上样完毕后，接通电源，电压为120V，约20min后停止电泳。2.3.5观察将凝胶置于凝胶成像系统中，打开紫外灯，观察DNA条带，拍照记录（见图2-1）。MaE2bE2aE3bE3aE5bE5ELE6LE6aE7bE7aEUbEllaE12bE12bE56图2-1 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，EB染色2.4测序采用PCR产物直接进行正反向测序的方法，样品纯化及序列分析由上海生工生物技术有限公司完成。所得序列与GenBank中正常人基因组序列比对，确定突变位点。2.5统计学分析选择卡方检验，检验水准a=0.05，用SPSS13.0统计软件进行分析。实验结果将实验测序得到的苯丙氨酸羟化酶（PAH）的exon及其侧翼序列与NCBI数据库中正常PAH基因序列进行比对，发现父亲和母亲均为PKU致病基因携带者，父亲的突变位点是intron4上的c.442-lG>A,母亲的突变位点是exon7上的c.728G>A，儿子分别遗传了父母的突变基因，为复合杂合突变类型（见表3-1和图3-1）,其中p.Arg243Gln为本次研究新发现（图3-2B,C）,在国际PAH数据库（http://www.mcgill.ca/pahdb）中尚未报到，提交并已被国际PAH基因突变数据库收录。另一苯丙酮尿症致病基因PTPS在家系中均未检测到突变。表3-1苯丙酮尿症致病基因苯丙氨酸羟化酶基因突变检测结果姓名核苷酸改变蛋白质改变突变位置突变类型父亲c.442-1G>A-I4剪接母亲c.728G>Ap.Arg243GlnE7错义儿子c.442-1G>A-I4剪接c.728G>Ap.Arg243GlnE7错义图3-1PAHintron4（I4）突变检测的测序结果。红色箭头所指为突变位点。A：父亲；B：母亲；C:儿子。TTCCCTCCTTCCCTCCG图3-2PAHexon7突变检测的测序结果。红色箭头所指为突变位点。A：父亲；B：母亲;C:儿子。4讨论PAH基因的突变大部分位于编码区的小的遗传学变化，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置。根据突变类型对PAH酶活性的影响情况，突变可分为致病突变和沉默突变两种。沉默突变对PAH酶活性无影响。致病突变大多位于exon，严重影响PAH基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响PAH的催化活性［19］。本研究共发现了2种突变，包括1种错义突变和1种剪接位点突变。其中剪接位点突变和由于直接影响了蛋白的转录或翻译，通常被认为是致病性突变，而错义突变的致病性质是需要经过体外表达、蛋白结构分析等进一步研究证明［20］。本研究的家系中PTPS基因没有显示突变，由于PTPS缺陷所致PKU发病率低，对一个家系而言突变是相对固定的。但是对于PTPS缺陷症进行产前基因诊断，可以对先证者和父母的突变分析的基础上，选择合适的分子生物学手段，如以PCR人工增加限制酶位点、DNA序列分析和最新发展的DNA芯片等技术，这样就可以对绝大多数PTPS缺陷症进行产前基因诊断。本课题对PKU患者PAH基因和PTPS基因突变位点的探讨，为家系PKU的研究提供重要补充资料，为有效降低PKU发病率，提供可靠科学依据，对减少PKU患儿的发生，提高人口素质具有重要意义，同时也为深入开展PKU的基因诊断、产前诊断以及今后的基因治疗奠定了基础。结论任何疾病的发生都是遗传物质和环境因素相互作用的结果。人类疾病基因和相关基因的定位、分离和克隆，为现代医学带来了空前的机遇。基因诊断是伴随着遗传学和细胞分子生物学理论和技术迅速发展而产生的一种新型诊断技术。在PKU疾病诊断过程当中，基因诊断为进一步的产前诊断，疾病筛查奠定基础，将向着高稳定性、高可靠性、高效率以及快速简便经济的方向发展，相信最终将会造福人类。参考文献顾学苑，新生儿筛查现状和展望[J],广东医学.2000,7,21(7):21-25.顾学范，苯丙酮尿症的诊断和治疗，广东医学,2000,21(7):535-536.AntshelKM,WaisbrenSE.Timingiseverything,executivefunctionsinchildrenexposedtoelevatedlevelsofphenylalanine[J].Neuropsychology,2003,17(3):458-468.WooSLC,LidskyAS,GuttlerFD,GuttlerF,ChandraT,KathrynJH,Robson.Clonedhumanphenylalaninehydroxylasegeneandallowsprenataldiagnosisandcarrieddetectionofclassicalphenylketonuria.Nature,1983,306:151-155.R.A.Williams,C.D.Mamotte,J.R.Burnett,Phenylketonuria:aninbornerrorofphenylalaninemetabolism,Clin.Biochem.29(2008)31-41.ScriverCR,WatersPJ,SarkissianC,RyanS,PrevostL,Cote'D,NovakJ,TeebiS,NowackiPM.PAHdb:alocus-specificknowledgebase.HumMutat,2000,15:99-104.ScriverCR,HurtubiseM,KoneckiD,PhommarinhM,PrevostL,ErlandsenH,StevenH,SteversR,WatersPJ,RyanS,McDonaldD,SarkissianC.PAHdb2003:whatalocus-specificknowledgebasecando.HumMutat,2003,21:333-344.'罗超权•基因诊断与基因治疗进展[M].第1版，河南:河南医科大学出版社,2000:79-81.CabibS,PascucciT,ThebehavioralprofileofseverementalretardationinageneticmousemodelofphenylketonuriaBehavGenet,2003,33(3):301-310.顾学范•苯丙酮尿症防治现状及进展•实用儿科临床杂志,2000,15(5):297-299.王慕逖.儿科学.人民卫生出版社,1996:140-142.HsiaoKJ,ChiangSH,LiuTTetal.TetrahydrobiopterindeficientphenylketonuriadetectedbyneonatalscreeninginTaiwan.In:CurtiusHC,GhislaS,BlauN,eds.Chemistryandbiologyofpteridines1989.Berlin:WalterdeGruyter,1990,402-407.NiederwieserA,ShintakuH,HaslerT,etal.Prenataldiagnosisof‘dihydrobiopterinsynthetase'deficiency,avariantformofphenylketonuria.EurJPediatr1986,145:176-178.BlauN,NiederwieserA,CurtiusH,etal.Prenataldiagnosisofatypicalphenylketonuria.JInherMetabDis,1989,12Suppl2:295-298.ShintakuH,FujiokaM,SawadaY,etal.Prenataldiagnosisof6pyruvoyltetrahydropterinsynthasedeficiencyinEastAsia.In:CurtiusHC,GhislaS,BlauN,eds.Chemistryandbiologyofpteridines1989.Berlin:WalterdeGruyter,1990.408-413.ScriverCR,HurtubiseM,KoneckiD,PhommarinhM,PrevostL,ErlandsenH,StevensR,WatersPJ,RyanS,McDonaldD,SarkssianC.PAHdb2003:whatalocus-specificknowledgebasecando.HumMutat,2003,21:333-344.IvaKaraLic'a,DavidMeilib,VladimirSarnavkac,etal.Genotype-predictedtetrahydrobiopterin(BH4)-res