临床免疫学和免疫检验概论

概论第01讲概论〔一〕学习免疫学的根本概念，了解临床免疫学的理论根底，掌握免疫技术的检测原理是学习和研究临床免疫学与免疫技术的重要保障。

免疫学简介

临床免疫学

临床免疫学和免疫检验免疫的概念

宿主体内的免疫系统，能识别并去除从外环境中侵入的病原生物及其产生的毒素、内环境中因基因突变产生的肿瘤细胞、自身衰老残损的组织细胞或自身变性抗原，实现免疫防御、免疫自稳和免疫监视的功能，保持机体内环境稳定。免疫系统免疫器官免疫细胞免疫分子中枢外周膜型分子分泌型分子胸腺骨髓脾脏、淋巴结、黏膜伴随淋巴组织淋巴细胞〔T细胞、B细胞、NK细胞〕

免疫辅助细胞〔吞噬细胞、树突状细胞等〕TCR

BCR

CD分子

粘附分子

MHC

其他免疫球蛋白

补体分子

细胞因子免疫系统-免疫器官与组织

中枢免疫器官免疫系统-免疫细胞

T细胞

B细胞

第02讲概论〔二〕免疫系统－免疫分子

1.免疫球蛋白

2.补体系统

3.细胞因子

4.黏附分子

5.CD抗原

人类白细胞分化抗原〔HLA〕是指血细胞在分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞外表标记分子。

采用单克隆抗体鉴定识别的自细胞分化抗原称CD抗原。

检测CD抗原是实验室识别细胞及不同分化阶段细胞或细胞亚群最主要的方法。免疫功能生理性〔有利〕病理性〔不利〕免疫防御抗感染免疫缺陷病

超敏反响免疫自稳去除损伤或衰老细胞自身免疫病免疫监视杀伤和去除

异常突变细胞肿瘤

持续病毒感染免疫应答

☆固有免疫，innateimmunity。

★适应性免疫，adaptiveimmunity。

体液免疫应答、细胞免疫应答。

临床免疫学

临床免疫学是将免疫学根底理论、临床疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制、诊断与鉴别诊断、评价治疗效果和判断预后的多个分支学科的总称。

免疫病理与免疫性疾病

移植免疫学

肿瘤免疫学

感染免疫学临床免疫学与免疫检验

临免疫检验可分为两局部，一局部为利用免疫检测原理与技术检测免疫相关物质；另一局部是利用免疫检测原理与技术检测体液中微量物质。【习题】

免疫的概念是指机体免疫系统具有

A.发现并排除有毒因子的能力

B.识别和排除抗原性异物的能力

C.抵抗并去除传染性因子的能力

D.发现和消除恶变细胞的能力

E.去除体内衰老损伤细胞的能力

『正确答案』B

『答案解析』免疫的概念是指机体免疫系统具有识别和排除抗原性异物的能力。机体免疫自稳功能低下，可导致

A.免疫缺陷病

B.免疫增殖病

C.自身免疫病

D.恶性肿瘤

E.超敏反响

『正确答案』C

『答案解析』免疫自稳是去除损伤或衰老细胞，功能低下时可导致自身免疫病。人体内最大的外周免疫器官是

A.胸腺

B.骨髓

C.脾

D.淋巴结

E.法氏囊

『正确答案』C

『答案解析』人体内最大的外周免疫器官是脾。可非特异直接杀伤靶细胞的是

A.NK细胞

B.Th细胞

C.Ts细胞

D.Tc细胞

E.TCRαβ＋细胞

『正确答案』A

『答案解析』NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞。新生儿从初乳中获得的Ig主要是

A.IgE

B.IgD

C.IgG

D.SIgA

E.IgM

『正确答案』D

『答案解析』新生儿从初乳中获得的Ig主要是SIgA。特异性免疫效应功能不包括

A.浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能

B.Th细胞分泌细胞因子等效应因子，执行细胞免疫功能

C.CTL细胞杀伤靶细胞

D.产生记忆细胞

E.中性粒细胞吞噬与杀灭细菌

『正确答案』E

『答案解析』中性粒细胞吞噬与杀灭细菌属于固有免疫，是非特异性免疫。粘膜伴随的淋巴组织主要的功能是

A.B、T淋巴细胞栖息和增殖场所

B.各种免疫细胞的发源地

C.T细胞分化成熟的场所

D.B细胞分化成熟的场所

E.主要产生IgA及分泌性IgA，执行体液免疫与局部特异免疫作用

『正确答案』E

『答案解析』粘膜伴随的淋巴组织主要的功能是分泌性IgA。抗原抗体反响第01讲抗原抗体反响抗原抗体反响

抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反响。

体内反响可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等体液免疫效应；

体外反响那么根据抗原、抗体性质的不同和反响条件的差异，在抗原抗体复合物形成后表现为不同的现象。包括：沉淀反响、凝集反响等。

★抗原抗体反响〔antigen-antibodyreaction〕

抗原抗体反响的原理

抗原抗体反响的特点

影响抗原抗体反响的因素

免疫学检测技术的类型

抗原抗体反响的原理

一、抗原抗体结合力

抗原和抗体的结合为分子间结构互补的特异结合，是一种非共价的结合，不形成牢固的共价键。在抗原抗体特异结合后有四种分子间引力参与并促进其结合。

静电引力

范德华引力

氢键

疏水作用力静电引力

〔electrostaticforces〕

范德华引力：作用最小。

〔vanderWaalsinteractions〕

氢键：最具特异性。

〔hydrogenbond〕

疏水作用力：作用最大。〔hydrophobicinteractions〕

二、抗原抗体的亲和力与亲合力

亲和性〔affinity〕

抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位之间结合强度，抗原抗体的亲和性取决于两者空间构型互补的程度。

亲合力〔avidity〕

指一个完整抗体分子的抗原结合部位与假设干相应抗原表位之间的结合强度。与亲和性、抗体结合价、抗原的有效抗原表位有关。

Avidity

TheoverallstrengthofbindingbetweenanAgwithmanydeterminantsandmultivalentAbs

三、亲水胶体转化为疏水胶体

抗原抗体反响的特点

特异性

可逆性

比例性

阶段性一、特异性

抗原与抗体结合反响的专一性

分子根底：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。

两种不同的抗原分子具有局部相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反响，称为交叉反响。二、比例性

抗原与抗体发生可见反响需遵循一定的量比关系

等价带：抗原抗体比例适宜。

带现象：抗原抗体比例不适宜。

前带：抗体过量。

后带：抗原过量。

三、可逆性

免疫复合物可在一定条件下解离为游离抗原与抗体

影响因素：

抗体对相应抗原的亲合力越高，结合越牢固，越不易解离。

环境因素对复合物的影响－pH、离子强度。

四、阶段性

影响抗原抗体反响的因素

一、反响物自身因素

1.抗原

抗原的理化性状、外表抗原决定簇的种类和数目均可影响抗原抗体反响的结果。

2.抗体

抗体的来源、浓度、特异性与亲和性均可影响抗原抗体反响。二、环境因素

电解质：生理盐水或缓冲液。

酸碱度：pH6～9。

温度：15℃～40℃，37℃最适。免疫学检验技术的类型

取决于：

抗原、抗体的性质

反响条件

其他参与成分

五种主要类型：

凝集反响

沉淀反响

补体参与的反响

中和反响

标记免疫反响【习题】

抗原抗体结合力中作用最大的是

A.静电引力

B.范德华引力

C.氢键结合力

D.疏水作用力

E.分子间结合力

『正确答案』D

『答案解析』抗原抗体结合力中作用最大的是疏水作用力。用抗原或抗体来检测相对应的抗体或抗原，是由于抗原抗体反响具有

A.特异性

B.比例性

C.可逆性

D.亲和性

E.带现象

『正确答案』A

『答案解析』抗原或抗体来检测相对应的抗体或抗原是由于抗原抗体反响具有特异性。抗原抗体反响比例不适宜出现的沉淀物减少的现象称为

A.前带

B.后带

C.带现象

D.等价带

E.等电点

『正确答案』C

『答案解析』抗原抗体反响比例不适宜出现的沉淀物减少的现象称为带现象。有关交叉反响的描述，正确的选项是

A.为非特异性抗原抗体反响

B.由于不同抗原分子上存在共同抗原表位所致

C.对免疫学诊断结果判断没影响

D.利用交叉反响进行诊断典型例子是肥达试验

E.利用交叉反响进行诊断典型例子是库姆试验

『正确答案』B

『答案解析』交叉反响是由于不同抗原分子上存在共同抗原表位。以下关于抗原抗体反响的特点表述，正确的选项是

A.抗原抗体反响有交叉反响，故抗原抗体反响特异性不强

B.抗原抗体反响必须抗体量略大于抗原量

C.抗原抗体反响形成的复合物又可解离为游离的抗原与抗体

D.抗体与抗原结合牢固，不易被解离

E.抗原抗体反响分为两个阶段，两个阶段之间有明显的界限

『正确答案』C

『答案解析』抗原抗体反响形成的复合物又可解离为游离的抗原与抗体，这是抗原抗体反响的可逆性。免疫原和抗血清的制备第01讲免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清的制备

抗原和抗体是免疫反响的根本条件也是免疫检验的两大重要因素。抗原是制备特异性抗体的前提条件，抗体可用于纯化抗原和检测抗原，也是医学检验中用于疾病诊断和研究的重要物质。

免疫原的制备

免疫佐剂

抗血清的制备

抗血清的鉴定和保存

抗血清的纯化颗粒性抗原的制备

颗粒性抗原主要是指细胞抗原和细菌抗原,制备的方法较简单,通过别离或纯培养即可得到。

细胞抗原——绵羊红细胞。

细菌抗原——菌体O抗原。

可溶性抗原的制备

可溶性抗原：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、细菌外毒素等。

〔一〕组织可溶性抗原的粗提

〔二〕可溶性抗原的纯化

〔三〕纯化抗原的鉴定〔一〕组织可溶性抗原的粗提

1.组织均浆的制备：高速组织捣碎机法、研磨法；

2.细胞的破碎：反复冻融法、超声破碎法、自溶法、酶处理法、外表活性剂处理法。

〔二〕可溶性抗原的提取和纯化

1.超速离心法；

2.选择性沉淀法：核酸去除法、盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法；

3.凝胶过滤法；

4.离子交换层析法；

5.亲和层析法；

6.电泳法。

〔三〕纯化抗原的鉴定

主要包括蛋白含量测定、分子量测定、纯度鉴定、免疫活性鉴定等。半抗原性免疫原的制备

半抗原只具有抗原性而无免疫原性；如某些多肽、多糖、激素、小分子量的药物等。半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。

〔一〕载体

1.蛋白质类：牛血白蛋白等；

2.多肽聚合物：多聚赖氨酸等；

3.大分子聚合物和某些颗粒：聚乙烯吡咯烷酮等。

〔二〕半抗原与载体的连接方法

1.物理方法：通过电荷和微孔吸附半抗原，吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等。

2.化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上。如碳二亚胺法、戊二醛法等。

〔三〕半抗原性免疫原的鉴定

与载体结合的半抗原数目与免疫原性密切相关。所以，应测定半抗原与载体的比例，方法有：①吸收光谱分析法：②放射性核素标记半抗原渗入法。免疫佐剂

指先于抗原或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答的物质。

佐剂的作用机制

①改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除；

②增强APC处理和提呈抗原的能力；

③刺激淋巴细胞增殖和分化；

④改变抗体的产生类型；

⑤诱导迟发型超敏反响。抗血清的制备

将制备好的免疫原按照一定的程序，免疫动物，使其产生多克隆抗体。然后采集动物血液，别离含有抗体的血清，即为抗血清。

免疫动物的选择

1.抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。

2.适龄、健康、体重适宜。

3.对于蛋白质抗原大局部动物皆适合，常用的是山羊和家兔。免疫程序

1.免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间确定。

2.免疫途径：初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射。

3.免疫间隔时间：重要因素。第1次与第2次免疫间隔时间以10～20天为好，第3次及以后的间隔一般为7～10天。动物采血法

1.颈动脉采血法

2.心脏采血法

3.静脉采血法抗血清的鉴定和保存

抗血清的鉴定

1.抗体特异性的鉴定

2.抗体效价的测定

3.抗体纯度的鉴定

4.抗体亲和力的鉴定抗血清的保存

①2～8℃保存：用于短期保存；

②冷冻保存：一般可保存5年；

③真空枯燥保存：用真空冻干机进行枯燥，在冰箱中可保存5～10年。抗血清的纯化

纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等。【习题】属于颗粒性抗原的是

A.脂多糖

B.球蛋白

C.白蛋白

D.DNA

E.血小板

『正确答案』E

『答案解析』颗粒性抗原包括血小板。可溶性抗原：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、细菌外毒素等。颗粒性抗原免疫接种方法一般采用

A.淋巴结注射

B.静脉注射

C.皮内注射

D.皮下注射

E.肌肉内注射

『正确答案』B

『答案解析』颗粒性抗原免疫接种方法一般采用静脉注射。要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的别离方法

A.盐析法

B.凝胶过滤法

C.离子交换层析法

D.免疫亲和层析法

E.免疫电泳法

『正确答案』A

『答案解析』盐析法是组织和细胞中粗提蛋白抗原最常用且简便的别离方法。纯化特异性抗体时，可采用以下哪种方法除去杂抗体

A.盐析法

B.凝胶过滤法

C.离子交换层析法

D.免疫亲和层析法

E.免疫电泳法

『正确答案』D

『答案解析』免疫亲和层析法能有效的去除杂抗体。蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫

A.7～10天

B.10～20天

C.20～30天

D.30～60天

E.3个月

『正确答案』B

『答案解析』蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔10～20天再进行第二次免疫。免疫小鼠的采血方法常为

A.静脉采血法

B.心脏采血法

C.颈动脉放血法

D.断尾法或摘除眼球法

E.股动脉放血法

『正确答案』D

『答案解析』免疫小鼠的采血方法常为断尾法或摘除眼球法。单克隆抗体与基因工程抗体的制备第01讲单克隆抗体与基因工程抗体的制备单克隆抗体与基因工程抗体的制备

由一个B细胞克隆产生的，针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体〔mAb〕。

第一代抗体：多克隆抗体〔pAb〕；

第二代抗体：单克隆抗体〔mAb〕；

第三代抗体：基因工程抗体〔GEAb〕。

杂交瘤技术的根本原理

单克隆抗体的制备

基因工程抗体制备

单克隆抗体的应用

GeorgesKohlerandCesarMilstein,1975,discoveredhybridomatechnique

1984杂交瘤技术

1.小鼠骨髓瘤细胞

①细胞株稳定，易于传代培养；

②细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子；

③次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶〔HGPRT〕的缺陷株。2.免疫脾细胞

①与骨髓瘤细胞同源的纯系小鼠；

②皮内多点注射抗原。

3.细胞融合

PEG可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易翻开而有助于细胞融合。

4.杂交瘤细胞的选择性培养

阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存

有限稀释法

有限稀释法单克隆抗体的制备

单克隆抗体的产生

体内诱生法

体外培养法：将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。单克隆抗体的纯化

①用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，到达初步浓缩和纯化的目的。

②经过适当溶解和充分稀释后，用亲和层析法进一步纯化。

单克隆抗体的性质鉴定

Ig类型测定、特异性测定、抗体效价测定、表位测定、亲和力测定。

单克隆抗体的特性

1.高度特异性。

2.高度的均一性和可重复性。

3.弱凝集反响和不呈现沉淀反响。

4.对环境敏感性。单克隆抗体的优点

〔1〕杂交瘤可以在体外“永久〞地存活并传代。

〔2〕可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。

〔3〕适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。

〔4〕由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

单克隆抗体的局限性

〔1〕单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。

〔2〕反响强度不如多克隆抗体。

〔3〕制备技术复杂，而且费时费工，价格较高。基因工程抗体制备

多克隆抗体和单克隆抗体来自异种动物，用于人体会引起很强的排斥反响。应用DNA重组及蛋白工程技术对抗体编码基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体。

①降低甚至消除人体对抗体的排斥反响；

②分子量较小，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；

③根据治疗的需要，制备新型抗体；

④生产本钱低。

人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白、双特异性抗体、噬菌体抗体库技术。单克隆抗体的应用

检验医学诊断试剂

单克隆抗体广泛应用于ELISA、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术，并且单克隆抗体的应用很大程度上促进了商品化试剂盒的开展。

①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定蛋白质的提纯

【习题】单克隆抗体目前效果较好的纯化方法

A.亲和层析法

B.凝胶过滤法

C.离子交换层析法

D.超速离心法

E.盐析法

『正确答案』A

『答案解析』单克隆抗体目前效果较好的纯化方法是亲和层析法。在HAT选择培养基中可长期存活者是

A.细胞多聚体

B.融合的脾细胞与瘤细胞

C.融合的瘤细胞与瘤细胞

D.未融合的瘤细胞

E.未融合的脾细胞

『正确答案』B

『答案解析』融合的脾细胞与瘤细胞能在HAT选择培养基中可长期存活。杂交瘤技术中的骨髓瘤细胞应具备的特点不包括

A.稳定和易培养

B.自身无分泌功能

C.细胞无恶性变化

D.融合度高

E.HGPRT缺陷

『正确答案』C

『答案解析』杂交瘤技术中的骨髓瘤细胞需要其恶性变化。小鼠骨髓瘤细胞与以下哪种细胞融合

A.经过免疫的B淋巴细胞

B.经过免疫的T淋巴细胞

C.未经过免疫的B淋巴细胞

D.未经过免疫的T淋巴细胞

E.淋巴细胞

『正确答案』A

『答案解析』小鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的B淋巴细胞融合。关于杂交瘤细胞特点的错误描述

A.具备了双亲细胞的特点

B.分泌人源性单克隆抗体

C.分泌鼠源性单克隆抗体

D.体外繁殖快速

E.能分泌抗体

『正确答案』B

『答案解析』杂交瘤细胞是分泌鼠源性单克隆抗体，而不是人源性单克隆抗体。HAT培养基中三种关键成分为

A.次黄嘌岭、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

B.黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

C.氨基嘌岭、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

D.腺嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

E.鸟嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

『正确答案』A

『答案解析』HAT培养基中三种关键成分为次黄嘌岭、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷。凝集反响第01讲凝集反响凝集反响

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反响。

凝集反响的特点

直接凝集反响

间接凝集反响

凝集反响的特点

1.可定性检测，也可进行半定量检测。

2.灵敏度高、方法简便，因而在临床检验中被广泛应用。

3.分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。直接凝集反响

细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。

玻片凝集试验

试管凝集试验

间接凝集反响

将可溶性抗原〔或抗体〕先吸附于适当大小的颗粒性载体外表〔致敏颗粒〕，然后与相应抗体〔或抗原〕作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反响。间接凝集反响的类型

1.正向间接凝集反响

可溶性抗原致敏载体，用于检测标本中相应抗体的方法。简便、快速、敏感性和特异性好，本钱低。2.反向间接凝集反响

选用特异性抗体致敏载体以检测标本中相应的抗原。3.间接凝集抑制反响

先将可溶性抗原〔或抗体〕与相应的抗体〔或抗原〕混合，然后再参加抗原〔或抗体〕致敏的红细胞，那么能抑制原先的血凝现象。

4.协同凝集反响

实质上是反向间接凝集试验，但所用载体是金黄色葡萄球菌。方法简便、快速、灵敏，可用于细菌、病毒、毒素及各种可溶性抗原的检测。间接血凝试验

是以红细胞作为载体的间接凝集试验。试验结果稳定，具有简便、快速、本钱低廉等特点，其敏感性高于胶乳凝集试验和直接凝集反响。

胶乳凝集试验

是以聚苯乙烯胶乳微粒〔0.8μm〕作为载体，将抗原〔或抗体〕与胶乳颗粒结合成为致敏乳胶后，直接用以检测标本中相应抗体〔或抗原〕的凝集反响。

明胶凝集试验

将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用时，假设血清含有抗病毒抗体那么可形成肉眼可见的粉红色凝集。

间接凝集反响的应用

快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备，可用于抗原或抗体的测定。【习题】试管凝集试验的效价判断标准是依据出现肉眼可见的如下凝集现象

A.+

B.+或++

C.++

D.+++

E.++++

『正确答案』C

『答案解析』试管凝集试验的效价判断标准是依据出现肉眼可见的++凝集现象。间接凝集反响不能检测

A.抗体

B.AFP抗原

C.伤寒沙门菌菌体抗原

D.类风湿因子

E.HCG抗原

『正确答案』C

『答案解析』伤寒沙门菌菌体抗原是颗粒性抗原，属于直接凝集反响。关于正向间接凝集试验说法错误的选项是

A.抗原致敏载体

B.用于检测标本中抗原

C.出现凝集那么为阳性

D.敏感性高

E.特异性强

『正确答案』B

『答案解析』正向间接凝集试验用于检测标本中抗体。关于间接血凝试验说法错误的选项是

A.红细胞作为载体

B.不能检测抗原

C.可检测抗体

D.可判断阳性反响的强弱

E.应用广泛

『正确答案』B

『答案解析』间接血凝试验可以检测抗原也可以检测抗体。关于反向间接凝集试验说法错误的选项是

A.抗体致敏载体

B.用于检测标本中抗原

C.出现凝集为阴性

D.敏感性高

E.特异性强

『正确答案』C

『答案解析』反向间接凝集试验出现凝集为阳性。关于间接凝集抑制试验说法错误的选项是

A.检测标本中抗原

B.出现凝集为阳性

C.抗体为诊断试剂

D.抗原致敏载体

E.不出现凝集为阳性

『正确答案』B

『答案解析』间接凝集抑制试验出现凝集为阴性。协同凝集试验所用的载体是

A.新鲜红细胞

B.洗涤红细胞

C.醛化红细胞

D.聚苯乙烯颗粒

E.金黄色葡萄球菌

『正确答案』E

『答案解析』协同凝集试验所用的载体是金黄色葡萄球菌。沉淀反响第01讲沉淀反响沉淀反响

蛋白质、多糖、毒素等可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合，出现的沉淀现象，称为沉淀反响。

沉淀反响的特点

液体内沉淀试验

凝胶内沉淀试验

免疫电泳技术沉淀反响的特点差异凝集反响沉淀反响抗原性质颗粒性抗原可溶性抗原反响时间数分钟数小时反响产物凝集物沉淀物敏感性高低液体内沉淀试验

受抗原抗体比例的影响非常明显，常用作测定抗原抗体的最适比例。有抗原稀释法、抗体稀释法和棋盘滴定法。免疫浊度测定

应用抗原、抗体在液相中反响后形成的免疫复合物微粒对光线的干扰，利用仪器进行定量检测的一种方法。

在一定范围内，吸光度与免疫复合物的量呈正相关。

免疫浊度测定的影响因素

1.抗原抗体比例

当反响液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最顶峰，这就是经典的海德堡曲线理论。2.抗体的质量

要求：抗体的特异性强、效价高、亲和力强。

R型＞H型。

3.抗原抗体反响的溶液

pH6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。

4.增浊剂

聚乙二醇〔PEG〕、吐温-20，可消除抗原或抗体分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。免疫比浊方法分类

透射和散射免疫比浊法

免疫胶乳比浊法

凝胶内沉淀试验

单向免疫扩散试验

Mancini曲线：适用大分子抗原和长时间扩散〔＞48小时〕的结果；

公式：c／d2＝k。

Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间〔＜24h〕扩散的结果处理，用半对数纸画线。

公式：logc／d＝k。双向免疫扩散试验

免疫电泳技术

免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反响的结合产物。

1.加快了反响速度

2.集中了扩散方向

3.分开了不同的蛋白

火箭免疫电泳

免疫电泳

免疫固定电泳

免疫固定电流模式图沉淀反响在医学检验中的应用方法评价应用经典沉淀反响试验操作繁琐、敏感度低、精密度差、时间长和难以自动化逐渐减少免疫比浊法稳定性好，敏感度高〔达ng／L〕，精确度，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合于大批量标本的检测血液、体液中蛋白质的测定免疫固定电泳技术分辨力强，敏感度高，结果易于分析M蛋白的鉴定与分型【习题】以下哪项不是沉淀反响的特点

A.其特性与经典抗原抗体反响相同

B.抗原是可溶性抗原

C.反响可分为两个阶段

D.抗体是McAb

E.需一定电解质

『正确答案』D

『答案解析』沉淀反响抗体不是单克隆抗体。Mancini曲线

A.适用于小分子抗原，扩散时间大于48h

B.适用于小分子抗原，扩散时间小于24h

C.适用于大分子抗原，扩散时间小于24h

D.抗原浓度与沉淀环直径的平方呈线性关系

E.使用半对数坐标纸作图

『正确答案』D

『答案解析』Mancini曲线抗原浓度与沉淀环直径的平方呈线性关系。单向琼脂扩散法可用于

A.抗体定性

B.抗体定量

C.抗原定性

D.抗原定量

E.抗体效价滴定

『正确答案』D

『答案解析』单向琼脂扩散法可用于抗原定量。双向琼脂扩散试验出现多条沉淀线的原因

A.抗原抗体过剩

B.抗原抗体相等

C.抗原抗体缺乏

D.抗原抗体不纯

E.抗原抗体分子量不等

『正确答案』D

『答案解析』双向琼脂扩散试验出现多条沉淀线是由于抗原抗体不纯。根据海德堡曲线，以下说法错误的选项是

A.抗原过量时产生钩状效应，沉淀物少

B.抗体过量时，沉淀物也少

C.抗原抗体比例适当时产生沉淀量最多

D.免疫比浊法中抗原过量导致测量失败

E.免疫比浊法中抗体过量导致测量失败

『正确答案』E

『答案解析』海德堡曲线免疫比浊法中抗原过量导致测量失败。放射免疫分析第01讲放射免疫分析放射免疫分析

放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反响特异性相结合的一种免疫技术。

放射免疫技术

放射免疫分析

免疫放射分析

放射免疫分析技术的应用

放射免疫技术

具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的开展起到了极大的推动作用。根本类型及原理

1.放射免疫分析〔RIA〕

2.免疫放射分析〔IRMA〕

常用的放射性核素

放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。使用最广泛的是125Ⅰ，可采用探测γ射线的晶体闪烁计数器测量。标志物制备及鉴定

125Ⅰ以放射性碘原子通过置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。

〔1〕氯胺T〔ch-T〕法。

〔2〕乳过氧化物酶标记法。

〔3〕间接标记法。

放射性标志物的纯化

〔1〕凝胶过滤法：分子筛。

〔2〕离子交换层析法：极性差异。

〔3〕聚丙烯酰胺凝胶电泳法〔PAGE〕：电荷和直径。

〔4〕高效液相色谱法。放射性标志物的鉴定

1.放射化学纯度：大于95%。

2.免疫活性：标志物与抗体结合的能力。

3.比放射性：标志物中所含的放射性强度。

方法学评价

除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：

〔1〕可靠性。

〔2〕剂量-反响曲线。

〔3〕高剂量钩状效应。放射免疫分析

放射免疫分析〔radioimmunoassay，RIA〕是以放射性核素标记的抗原与反响系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为根本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。

Ag*+Ag+AbAg*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag

别离结合与游离标志物

1.第二抗体沉淀法。

2.聚乙二醇〔PEG〕沉淀法。

3.PR试剂法：先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。

4.活性炭吸附法。放射性测量及数据处理

可对标记抗原抗体复合物〔B〕或游离标记抗原〔F〕进行放射性测量，绘制标准曲线，查出相应的待检抗原浓度。

免疫放射分析

免疫放射分析〔immunoradiometricassay，IRMA〕是以过量125Ⅰ标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反响，用固相免疫吸附剂对B或F进行别离，其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较RIA简单。

Ag+Ab*Ag-Ab*+Ab*单位点IRMA

过量标记抗体与待测抗原进行反响，平衡后，再用固相抗原结合反响液中剩余的未结合标记抗体并将其别离，测定上清液的放射量。

双位点IRMA

形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃反响液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。

RIA与IRMA的比拟RIAIRMA标记物质核素标记Ag核素标记Ab反响速率较慢较快反响原理竞争抑制非竞争性结合特异性特异性较低特异性较强分析误差较大较小标记物量限量过量应用可测大分子量、小分子量的物质测定2个以上抗原表位的物质放射免疫分析技术的应用

常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。

由于放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，试剂盒有效期不长，无法自动化分析等诸多缺乏。【习题】以下何种物质不常用放射免疫技术分析

A.激素

B.微量蛋白质

C.肿瘤标志物

D.药物

E.抗核抗体

『正确答案』E

『答案解析』放射免疫技术分析常用于检测抗原类的物质。125I标记物的放射化学纯度要求

A.＞80%

B.＞90%

C.＞95%

D.＞98%

E.＞99%

『正确答案』C

『答案解析』125I标记物的放射化学纯度要求＞95%。关于RIA，以下说法正确的选项是

A.标记抗原限量

B.标记抗体限量

C.抗体限量

D.标准抗原限量

E.待测抗原限量

『正确答案』C

『答案解析』RIA是以放射性核素标记的抗原与反响系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为根本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法关于IRMA说法正确的选项是

A.反响中参加过量的标记抗原

B.反响中参加定量的标记抗原

C.反响中参加过量抗体

D.反响中参加过量的标记抗体

E.反响中参加定量的标记抗体

『正确答案』D

『答案解析』IRMA是以过量125Ⅰ标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反响，用固相免疫吸附剂对B或F进行别离，其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较RIA简单。关于单位点IRMA说法正确的选项是

A.首先参加固相抗原与待测标本

B.然后参加标记抗体

C.测定固相免疫复合物的放射量

D.测定上清液的放射量

E.待测抗原需含二个以上表位

『正确答案』D

『答案解析』单位点IRMA，过量标记抗体与待测抗原进行反响，平衡后，再用固相抗原结合反响液中剩余的未结合标记抗体并将其别离，测定上清液的放射量。关于IRMA与RIA，说法错误的选项是

A.IRMA较RIA特异性高

B.IRMA较RIA灵敏度高

C.IRMA较RIA标准曲线工作范围宽

D.IRMA所用抗体较少

E.RIA所用抗体较少

『正确答案』D

『答案解析』RIA所用抗体较少。荧光免疫技术第01讲荧光免疫技术将抗原抗体反响与荧光技术相结合而建立的一种免疫标记技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。

概述

荧光抗体技术

荧光免疫分析的类型

荧光免疫技术在医学检验中的应用

荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。荧光

荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。

荧光物质异硫氰酸荧光素

〔FITC〕四乙基罗丹明

〔RB200〕四甲基异硫氰酸罗丹明

〔TRITC〕藻红蛋白

〔PE〕性状黄色粉末橘红色粉末紫红色粉末褐红色粉末溶解性易溶于水或乙醇等溶剂不溶于水，易溶于乙醇和丙酮不溶于水，易溶于乙醇和丙酮不溶于水，易溶于乙醇和丙酮最大吸收光波长490～495nm570nm550nm565nm最大发射光波长520～530nm595～600nm620nm578nm荧光颜色黄绿色橘红色橙红色橙色荧光应用最广泛常用有毒性常用其他荧光物质

铕〔Eu3＋〕为三价稀土镧系元素，其螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。

荧光抗体技术

荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反响，经洗涤别离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位。荧光抗体技术包括荧光抗体制备、标本制作、荧光抗体染色和荧光显微镜检查等内容。荧光抗体的制备

1.抗体要求：用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。

2.荧光素要求：①与蛋白质结合后不易解离，而未结合者易于去除；②荧光效率高；③荧光色泽与背景组织比照鲜明；④不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、平安无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

3.抗体的荧光素标记：搅拌法和透析法。

4.荧光素标记抗体的纯化：去除未结合的游离的荧光素。可采用透析法或层析别离法。

5.荧光抗体的鉴定：荧光素与蛋白质的结合比率〔组织切片的荧光抗体染色以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色以F/P＝2.4为宜〕、抗体效价、抗体特异性。

6.荧光抗体的保存：小量分装，-20℃冻存可保存1～2年。真空枯燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。标本的制作

临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。制作标本要力求保持抗原的完整性、切片要求尽量薄、干扰物质要充分洗去、平安。

荧光抗体染色与结果判断

1.直接法

用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。

2.间接法

可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体〔荧光抗体〕为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。3.双标记法

本法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。

4.荧光抗体染色结果判断

每次实验时均需设立严格的实验对照〔阳性和阴性对照〕。阳性细胞的显色分布有胞质型、胞核型和膜外表型三种类型，显色深浅可作为抗原定性、定位和定量的依据。荧光显微镜

荧光显微镜能发射出一定波长的激发光对待测样本进行激发，使之产生一定波长的发射荧光，从而对组织细胞的结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。荧光显微镜与普通光学显微镜主要结构根本相同，不同之处在于光源、滤光片、聚光器和消色差镜头等。

荧光免疫分析的类型

常用的荧光免疫分析测定方法主要有流式细胞分析技术、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定等。

时间分辨荧光免疫测定〔TRFIA〕

用镧系元素〔Eu3+〕标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。1.时间分辨：非特异性荧光寿命较短〔1～10ns〕，最长不超过20ns。而镧系元素螯合物的荧光寿命较长〔10～1000μs〕。

2.Stokes位移：激发光谱和发射光谱的波长之差很大〔273nm〕，故极易将激发光和发射光分开。

3.发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±10nm。利用615nm±5nm的滤光片只允许此波段的荧光通过，以供测量，排除了其余波长的荧光，且能量损失也不大。

4.信号增强：免疫反响完成后，参加酸性增强液，Eu3＋从复合物上完全解离下来，被另一种螯合剂所螯合，形成一个新的具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。标记物和标记方法

Eu3＋最为常用。Eu3＋不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子一螯合剂一抗原〔或抗体〕复合物。

方法类型

1.双抗体夹心法

双抗体夹心法待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-Eu3+标记抗体复合物，在酸性增强液作用下，复合物上的Eu3+从免疫复合物中解离，形成新的微粒，在340nm激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发射613nm的荧光。经时间分辨荧光分析仪记录计算出待检抗原的含量。方法类型

2.固相抗体竞争法

待检抗原和Eu3＋标记的抗原与固相抗体发生竞争结合。

方法类型

3.固相抗原竞争法

待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3＋标记抗体。

方法评价

时间分辨荧光免疫测定灵敏度高；分析范围宽；标记结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易自动化；无放射性污染。荧光偏振免疫测定

当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的平面光，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光〔蓝光，485nm〕激发后，可吸收光能并发射出相应的偏振荧光〔绿光，525～550nm〕，偏振荧光有很强的方向性。

AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱

AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强

待检抗原含量与偏振荧光强度成反比

方法评价

荧光偏振免疫测定样品用量少；荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；方法重复性好；快速，易自动化；试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质。荧光酶免疫测定

某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。标记酶底物荧光产物激发光

〔nm〕荧光

〔nm〕碱性磷酸酶4-MUP4-MU360450〔蓝〕β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU360450辣根过氧化物酶HPA二聚体317414〔紫〕注：4-MUP〔4-甲基伞酮磷酸盐〕；4-MUG〔4-甲基伞酮-β-半乳糖苷〕；4-MU〔4-甲基伞酮〕；HPA〔对羟基苯丙酸〕方法类型

1.双抗体夹心法：固相抗体-待测抗原-酶标记抗体

2.双抗原夹心法：固相抗原-待测抗体-酶标记抗原

3.固相抗原竞争法：待测抗原+固相抗原+定量酶标记抗体

方法评价

荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物的化学反响作为放大系统，故灵敏度大大提高。

背景荧光会干扰测定，用固相荧光酶免疫测定法效果好。

荧光免疫技术在医学检验中的应用

一、荧光抗体技术的应用

1.自身抗体检测，辅助诊断自身免疫性疾病。

2.病原体检测，用于疾病诊断、流行病学调查和临床回忆诊断。

3.免疫病理检测，用于组织中抗原、抗体的鉴定。

4.细胞外表抗原和受体检测。

荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析。在这种分析法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射后发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

二、荧光免疫测定的应用

时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，包括蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、病原体抗原/抗体等；荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子物质的测定；荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测。【习题】目前使用最广泛的荧光色素为

A.FITC

B.RB200

C.TRITC

D.R-RE

E.Eu3+

『正确答案』A

『答案解析』目前使用最广泛的荧光色素为FITC。【习题】RB200产生的荧光色泽为

A.橘红色

B.黄绿色

C.蓝紫色

D.天青色

E.褐黑色

『正确答案』A

『答案解析』RB200产生的荧光色泽为橘红色。【习题】荧光抗体间接法可检测

A.抗原

B.抗体

C.补体

D.蛋白质

E.抗原和抗体

『正确答案』E

『答案解析』荧光抗体间接法可检测抗原和抗体。【习题】主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术

A.荧光偏振免疫测定

B.荧光免疫显微技术

C.时间分辨荧光免疫测定

D.底物标记荧光免疫测定

E.流式荧光免疫技术

『正确答案』C

『答案解析』时间分辨荧光免疫测定主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原。【习题】最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质

A.异硫氰酸荧光素

B.四乙基罗丹明

C.四甲基异硫氰酸罗丹明

D.藻红蛋白

E.镧系稀土元素〔Eu〕

『正确答案』E

『答案解析』最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质是镧系稀土元素〔Eu〕。【习题】关于直接法荧光抗体染色的特点，错误的选项是

A.简单易行，特异性高

B.敏感度偏低

C.非特异性荧光染色因素少

D.可检测抗原及抗体

E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体

『正确答案』D

『答案解析』间接法可以用于检测抗原和抗体，不是直接法。酶免疫技术第01讲酶免疫技术酶免疫技术是将抗原抗体反响的特异性和酶高效催化反响的专一性相结合的一种免疫检测技术。

酶免疫技术的特点

酶免疫技术的分类

酶联免疫吸附试验

酶免疫测定的应用

既保存了抗体或抗原的免疫学活性，又保存了酶对底物的催化活性和生物放大作用。可通过酶对底物的显色反响，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反响的敏感性。

酶免疫技术的特点

既保存了抗体或抗原的免疫学活性，又保存了酶对底物的催化活性和生物放大作用。可通过酶对底物的显色反响，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反响的敏感性。

酶和酶作用底物

〔一〕酶的要求

一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物，用酶标记抗体或抗原建立酶免疫测定法，可使免疫反响的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度，为此用于标记的酶应符合以下要求：

1.酶的活性要强，转化率高，纯度高。

2.易与抗体或抗原偶联，活性保持稳定。

3.作用专一性强，无内源性酶或抑制物。

4.易于判断或测量，方法简单、敏感和重复性好。

5.无害，易得。〔二〕常用的酶

1.辣根过氧化物酶〔HRP〕；

HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白〔主酶〕和亚铁血红蛋白〔辅基〕结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶那么与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。HRP的纯度用RZ表示，它是以HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值来表示的。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。

2.碱性磷酸酶〔AP〕

AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。

3.β-半乳糖苷酶〔β-Gal〕。

〔三〕常用的底物

1.邻苯二胺〔OPD〕：是ELISA中应用最早的底物，HRP的敏感底物之一。在HRP的作用下显橙黄色，加强酸终止反响后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。但稳定性差，易变色，具有致癌性。

2.四甲基联苯胺〔TMB〕：HRP新型底物。经HRP作用后变为蓝色，参加硫酸终止反响后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。TMB具有稳定性好，成色无需避光，无致突变作用等优点。缺点是水溶性相对较差。

3.对-硝基苯磷酸脂〔p-NPP〕：p-NPP经碱性磷酸酶作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

4.4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷〔4-MUU〕：β-半乳糖苷酶〔β-Gal〕的底物。酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞酮〔4-MU〕，其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。酶标记抗体或抗原

标记方法要求：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反响不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。

常用的标记方法有戊二醛交联法和改进过碘酸钠法两种。

常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G-200／G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯等。鉴定包括酶活性和抗体〔抗原〕的免疫活性鉴定。

固相载体

要求：结合抗体或抗原的容量大；牢固地固定抗原或抗体；不影响抗体或抗原的免疫反响性，固相方法简便易行，快速经济。种类：

1.塑料制品：聚苯乙烯塑料，物理吸附；

2.微粒：带有能与蛋白质结合的功能基团，易与抗体〔抗原〕形成化学偶联；

3.膜载体：常有硝酸纤维素膜〔Nc〕、玻璃纤维素膜等微孔滤膜，物理吸附。

包被与封闭：

包被的蛋白质浓度过低，需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除干扰。

酶免疫技术的分类

均相酶免疫测定

利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离酶标志物别离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。

最早取得临床实际应用的均相酶免疫试验是酶放大免疫测定技术〔EMIT〕，随着新的均相酶免疫试验的开展，目前最为成功的是克隆酶供体免疫测定〔CEDIA〕。

〔一〕酶放大免疫测定技术〔EMIT〕

常用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和溶菌酶。

酶放大免疫测定技术〔EMIT〕：EMIT的根本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保存半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反响后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。〔二〕克隆酶供体免疫分析〔CEDIA〕

基因重组技术克隆表达的B-D-半乳糖苷酶片段：EA+ED。

主要用于药物和小分子物质的测定。

克隆酶供体免疫分析〔CDEIA〕DNA重组技术可分别合成某种功能酶〔如P-D半乳糖苷酶〕分子的两个片段，大片段称为酶受体〔EA〕，小分子称作酶供体〔ED〕，两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。异相酶免疫测定

〔一〕异相液相酶免疫测定

将酶标抗原、待测抗原与特异性抗体同时混合〔平衡法〕，或先将待测抗原与特异性抗体混合反响一定时间后，再参加酶标抗原〔非平衡法〕，抗原抗体反响到达平衡后，参加二抗，经离心沉淀，将游离的酶标记物与结合的酶标记物别离，测定沉淀物中酶的活性。

〔二〕固相酶免疫测定

酶联免疫吸附试验〔ELISA〕。ELISA根本原理

免疫反响，包括抗原、抗体、酶标记物之间的反响；

酶与底物反响，可以使用不同的酶/底物系统；

检测方法的建立，利用各种分析方法对酶催化反响的产物进行定量分析。ELISA方法类型

检测抗原的方法

双抗体夹心法

属于非竞争结合测定，是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其根本原理是先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；参加待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反响，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物；然后参加酶标抗体并温育。使固相抗原抗体复合物与酶标抗体结合，形成固相抗体一待测抗原一酶标记抗体复合物〔双抗体夹心〕，洗涤除去未结合酶标记抗体；加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反响的程度进行该抗原的定性或定量检测。

双位点一步法

在双抗体夹心法根底上，进一步开展了双位点一步法。该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。

竞争法

主要用于测定小分子抗原。大分子抗原因其具两个以上的抗原决定簇，多采用双抗体夹心法测定，而小分子半抗原〔药物、激素等〕只有一个抗原决定簇，只能采用竞争法测定。

间接法

间接法检测抗体最常用的方法，属非竞争性结合试验。

双抗原夹心法

捕获法

又称反向间接法。主要用于血清中某种抗体亚型成分〔如IgM〕的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。

酶免疫测定的应用

几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用酶免疫测定检测。具有高度的敏感性和特异性，操作简便以及试剂稳定，对环境没有污染，已经成为临床免疫检验中的主导技术。【习题】HRP的活性基团是

A.糖蛋白

B.亚铁血红素

C.白蛋白

D.球蛋白

E.色氨酸

『正确答案』B

『答案解析』HRP的活性基团是亚铁血红素。【习题】以下酶-底物-颜色反响组合中，正确的选项是

A.HRP-OPD-蓝色

B.HRP-TMB-红色

C.AP-p-NPP-黄色

D.HRP-p-NPP-蓝色

E.AP-TMB-蓝色

『正确答案』C

『答案解析』对-硝基苯磷酸脂p-NPP经AP作用后的产物为黄色。【习题】EMIT测定可以测定

A.大分子抗原

B.小分子抗原或半抗原

C.补体

D.PCAb

E.MCAb

『正确答案』B

『答案解析』EMIT测定小分子抗原或半抗原。【习题】反响结束时，阴性对照管的呈色最强，常见于

A.双抗体夹心法ELISA

B.竞争法ELISA

C.间接法ELISA

D.捕获法ELISA

E.双抗原夹心法ELISA

『正确答案』B

『答案解析』竞争法ELISA反响结束时，阴性对照管的呈色最强。【习题】间接法ELISA中，形成的免疫复合物是

A.固相抗原-抗体-酶标二抗

B.固相抗体-抗原-酶标抗体

C.固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体

D.固相抗体-酶标抗原

E.固相抗原-抗体-酶标抗原

『正确答案』A

『答案解析』间接法ELISA中，形成的免疫复合物是固相抗原-抗体-酶标二抗。【习题】ELISA双抗体夹心法是

A.酶标记特异抗体用于抗原的检测

B.先将待测抗原包被于固相载体

C.标记一种抗体可检测多种抗原

D.能用于半抗原的测定

E.属竞争结合测定

『正确答案』A

『答案解析』ELISA双抗体夹心法是酶标记特异抗体用于抗原的检测。化学发光免疫分析技术第01讲化学发光免疫分析技术发光免疫分析是将发光分析和免疫反响相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。兼有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反响的高特异性。概述

发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态〔较低能级〕跃迁到激发态〔较高能级〕，然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为光照发光、生物发光、化学发光等。

化学发光与荧光的区别是形成激发态分子的激发能不同。

化学发光

某些物质〔发光剂〕在化学反响时，吸收了反响过程中所产生的化学能，使反响的产物分子或反响的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。

化学发光剂和标记技术

化学发光剂的条件

①发光的量子产率高；②物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反响的结果；⑤对生物体没有毒性。

化学发光剂

〔一〕直接化学发光剂

直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反响，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。

〔二〕酶促反响发光剂

利用标记酶的催化作用，使发光剂〔底物〕发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反响发光剂。目前化学发光酶免疫分析中常用的标记酶有辣根过氧化物酶〔HRP〕和碱性磷酸酶。辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物；碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD。

3-〔2-螺旋金刚烷〕-4-甲氧基-〔3-磷氧酰〕-苯基-1,2-二氧乙烷〔AMPPD〕发光剂的标记技术

〔一〕常用标记方法

1.碳二亚胺缩合法。

2.过碘酸钠氧化法。

3.重氮盐偶联法。

4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法。〔二〕影响标记的因素

1.发光剂的选择、被标记蛋白质的性质。

2.标记方法的选择。

3.原料比、标记率。

4.温度。

5.纯化与保存。

化学发光免疫分析的类型

化学发光免疫分析〔CLIA〕是将化学发光与免疫反响相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫分析技术。CLIA具有灵敏度高、特异性强、无放射性危害等优点。

直接化学发光免疫分析

吖啶酯反响简单快速，不需催化剂；

发光迅速，背景噪音低，保证了敏感性；

与抗原/抗体结合稳定，不影响其活性和理化特性；

瞬间发光，持续时间短，对信号检测仪的灵敏度要求高。化学发光酶免疫分析〔CLEIA〕

是用参与催化某一化学发光反响的酶如辣根过氧化物酶〔HRP〕或碱性磷酸酶〔ALP〕来标记抗体〔或抗原〕，与待测标本中相应的抗原〔抗体〕发生免疫反响后，形成固相包被抗体一待测抗原一酶标记抗体复合物，经洗涤后，参加底物〔发光剂〕，酶催化和分解底物发光。由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。

属酶免疫测定范畴，测定过程与ELISA相似；

酶标记抗原或抗体结合稳定；

酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发出的光稳定，持续时间长，便于记录和测定。电化学发光免疫分析

可周而复始地发光，持续时间长，信号强度高，容易测定，容易控制；

三联吡啶钌直接标记抗原/抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性；

试剂灵敏度高，稳定性好。临床应用

由于化学发光免疫测定技术无放射性污染，同时能到达放射免疫测定的灵敏度，而且还具有快速、准确、特异、可自动化等特点，因此已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、药物浓度及其他微量生物活性物质的测定。常用的HRP发光底物为

A.鲁米诺或其衍生物

B.AMPPD

C.TMB

D.吖啶酯

E.三联吡啶钌

『正确答案』A

『答案解析』常用的HRP发光底物为鲁米诺或其衍生物。直接化学发光免疫分析的标记物为

A.碱性磷酸酶

B.三联吡啶钌[Rubpy〕3]2+

C.吖啶酯

D.鲁米诺

E.鲁米诺衍生物

『正确答案』C

『答案解析』直接化学发光免疫分析的标记物为吖啶酯。关于电化学发光免疫分析，以下描述错误的选项是

A.由电化学引发的特异性化学发光反响

B.包括了电化学反响和光致发光两个过程

C.化学发光剂主要是三联吡啶钌[Rubpy〕3]2+

D.有双抗体夹心法、固相抗原竞争法等模式

E.以磁性微珠作为别离载体

『正确答案』B

『答案解析』电化学发光免疫分析包括了电化学和化学发光两个过程。关于电化学发光免疫测定检测血清HCG含量，以下描述错误的选项是

A.常用的检测方法是双抗体夹心法

B.常用磁珠别离技术

C.标记物是ALP-抗HCG抗体

D.B/F别离剂是抗HCG抗体包被的磁颗粒

E.发光反响需要三丙胺参与

『正确答案』C

『答案解析』电化学发光免疫测定HCG标记物应该是三联吡啶钌。生物素-亲和素放大技术第01讲生物素-亲和素放大技术生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反响时具有的多级放大作用等优越性。

生物素的理化性质与标记

亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记

生物素-亲和素系统的特点

生物素-亲和素系统的应用

生物素的理化性质与标记

生物素〔biotin，B〕广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。

活化生物素

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，使之容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。包括能标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸的活化生物素。

常用于标记核酸分子的活化生物素有以下几种：

1.光敏生物素它是一种化学合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的标记。

2.生物素脱氧核苷三磷酸先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。

3.BNHS和BHZ二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。生物素标记蛋白质

〔一〕生物素化蛋白质衍生物

有两类，一种是生物素化的大分子活性物质〔如抗原、抗体〕，另一种是标记材料〔如酶〕结合生物素后制成的标志物。而且一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，从而使其具有较高的比活性，在与亲和素的反响中成为多价。生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质根底。生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质〔如抗原、抗体〕，另一种是标记材料〔如酶〕结合生物素后制成的标志物。

〔二〕标记考前须知

1.选择正确的活化生物素和反响条件；

2.应有适当的比例，以免影响被标志物的活性；

3.可在生物素与被标志物间参加交联臂样结构；

4.不影响被标记物的免疫活性。

亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记

亲和素〔AV〕和链霉亲和素〔SA〕是生物亲和素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，几乎所有用于标记的物质均可以与之结合。

亲和素及其活性

常从卵白蛋白中提取；

四聚体，可结合4个生物素分子；

性质稳定、耐热、耐多种蛋白水解酶作用。

链霉亲和素及其活性

由链霉菌分泌的蛋白质；

可结合4个生物素分子。

链霉亲和素〔SA〕因外表所带正电荷少，且不含糖基，在实验中的非特异性结合远低于亲和素。

亲和素〔或链霉亲和素〕的标记

用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有125Ⅰ、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质如酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素〔FITC〕和胶体金。

生物素-亲和素系统的特点

BAS结合的多级放大作用，既可偶联生物大分子，又可连接标记材料，用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质，用于上述各类反响体系中反响物的别离、纯化。BAS在实际应用中所具有的优越性主要表现在以下几个方面：

灵敏度

1.生物素结合后，保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具多价性。

2.多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。

特异性

1.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反响呈高度专一性。

2.最大限度地降低反响试剂的非特异作用。

稳定性

1.亲和素与生物素间的亲和常数比抗原抗体反响至少高1万倍，呈不可逆反响性。

2.产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。

适用性

1.用于多种生物学反响体系；

2.高工作效价，可降低抗体用量，节约本钱；

3.生物素化标记物稳定性好，有效期长。

生物素-亲和素系统的应用

BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的奉献。此外在核酸探针标记、细胞和生物活性物质别离提纯等方面也显示了明显的优越性。生物素-亲和素系统根本类型及原理

1.BAB法

BAB法也称为桥联亲和素-标记生物素法〔BRAB〕，是以游离的亲和素〔或链霉亲和素〕作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将检测反响体系中抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素〔如酶标生物素〕连接起来，到达检测反响分子的目的。

2.ABC法

ABC法是在BAB法根底上的改进，其原理是预先按一定比例将亲和素〔或链霉亲和素〕与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素〔或链霉亲和素〕-生物素-过氧化物酶复合物〔ABC或SABC〕。当其与检测反响体系中的生物素化抗体〔直接法〕或生物素化第二抗体〔间接法〕相遇时，ABC〔或SABC〕中未饱和的亲和素〔或链霉亲和素〕结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反响体系与ABC〔或SABC〕标记体系连成一体进行检测。

亲和素-生物素-E3.BA法

BA〔或LAB〕法是以标记亲和素〔或链霉亲和素〕直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。

生物素-亲和素系统在临床中的应用

1.标记物稳定，试剂有效期长；

2.灵敏度高，特异性强；

3.自动化程度高，检测菜单齐全。习题每个亲和素能结合多少个分子的生物素

A.1

B.2

C.3

D.4

E.5

『正确答案』D

『答案解析』每个亲和素能结合4个分子的生物素。生物素-亲合素系统〔BAS〕的特点不包括

A.亲合素分子可以结合4个生物素分子

B.反响受抗原抗体比例影响较大

C.亲合素和生物素有极强的亲和力，起多级放大作用的特异性

D.亲合素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合

E生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合

『正确答案』B

『答案解析』BAS用于微量抗原抗体及受体的定量定性检测及定位观察研究。抗原抗体的比例对其影响不大。