饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA

《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义阪崎肠杆菌(Enterobactersakazaii )是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，属条件性致病菌。自1961年，英国首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%〜80%。因此，对阪崎肠杆菌活菌建立快速、特异、灵敏的检测标准对于该菌的早期发现及传播的有效控制至关重要。目前阪崎肠杆菌的检测方法较多，主要有传统培养方法和分子生物学方法。我国目前采用传统的细菌学方法，检测时间需要一周左右，费时费力；分子生物学方法虽然快速，灵敏，但不能区分死菌与活菌，而死菌DNA的存在容易导致假阳性问题。本研究以阪崎肠杆菌16SrDNA保守序列为靶基因设计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分阪崎肠杆菌的死菌与活菌避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果,同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测阪崎肠杆菌的灵敏度在1.0X102cfu/mL左右，从样品处理、预增菌、PCR扩增、凝胶电泳只需要48h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中阪崎肠杆菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210482）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：GB4789.40-2016食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验；GB19489实验室生物安全通用要求；GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：阪崎肠杆菌活菌EMA-PCR检测方法的建立引物设计根据阪崎肠杆菌16SrDNA设计一对特异性引物。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增932bp大小的特异性引物对。表1引物序列引物序列片段大小上游5'-CTGCTCTGCTGACGAGTGG-3'932bp下游5'-CATCTCTGCAGGATTCTCTGGA-3'EMA-PCR方法参数的优化首先是探索阪崎肠杆菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液,采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、lOmin,离心收集上清液，进行PCR扩增。确定方法的灵敏度和特异性。用建立的阪崎肠杆菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与GB4789.40克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验比对,以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：阪崎肠杆菌EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行阪崎肠杆菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批阪崎肠杆菌阳性样品，并对阪崎肠杆菌进行了分离鉴定。同时与GB4789.40《克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法GB4789.40检测结果完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间。通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。第三阶段：标准的起草、修改与制定根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》河南省地方标准草案，规定了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法（草案）》。项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。主要起草人：高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和检测方法的优化。董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。李金磊：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和优化。四、主要内容的确定检测方法基本原理EMA能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其基因组DNA发生不可逆转的结合，使死细菌和游离状态的DNA不能作为模板进行PCR扩增。根据阪崎肠杆菌的16SrDNA基因设计一对特异性引物，通过对样品进行EMA处理然后进行PCR扩增及凝胶电泳分析，含阪崎肠杆菌活菌的样品会在932bp处出现一条目的条带，而含有阪崎肠杆菌死菌及非阪崎肠杆菌的样品不会出现该条带。最佳致死方法、EMA浓度及曝光时间向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的0.5麦氏单位(MCF)阪崎肠杆菌菌悬液中分别加入EMA，使其终浓度分别为0、0.5、1、2、4、 8ug/mL,PCR结果电泳图分别为图1,图2,图3。由图可以看出煮沸法致死效果最理想，加入EMA终浓度为0.5ug/mL既能完全抑制0.5MCF阪崎肠杆菌死菌的扩增。另向0.5MCF活菌菌悬液加入EMA，使其终浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18ug/mL，PCR电泳结果如图4。由图可以看出加入终浓度为8ug/mL的EMA样品PCR电泳条仍无明显减弱,表明终浓度W8ug/mL的EMA添加量不会抑制阪崎肠杆菌活菌的扩增。lOflO——750 SCClOflO——750 SCC——250——100'—M1 2 3 4 5 6 7图1煮沸处理注：M：Marker；1：阴性对照；2：0口g/mLEMA；3：0.5口g/mLEMA；4：1口g/mL

EMA；5：2口g/mLEMA；6：4口g/mLEMA；7:8口g/mLEMAbp200D1000750500250100图2紫外照射处理注：M：Marker；1：阴性对照；2：0口g/mLEMA；3：0.5口g/mLEMA；4：1口g/mL

EMA；5：2口g/mLEMA；6：4口g/mLEMA；7:8口g/mLEMA

2D0010002D007505盹250100图3异丙醇处理注：M：Marker；1：阴性对照；2：0口g/mLEMA；3：0.5口g/mLEMA；4：1口g/mL

EMA；5：2口g/mLEMA；6：4口g/mLEMA；7:8口图3异丙醇处理200010002000750500250100M25 67S9 10 11图4EMA抑制阪崎肠杆菌活菌浓度注：M：Marker；1：阴性对照；2：0口g/mLEMA；3：2ug/mLEMA；4：4口g/mLEMA；

5：6ug/mLEMA；6：8ug/mLEMA；7:M25 67S9 10 11图4EMA抑制阪崎肠杆菌活菌浓度9：14ug/mLEMA；10：16ug/mLEMA；11：18ug/mLEMA向煮沸致死0.5MCF的阪崎肠杆菌菌悬液中加入EMA,使其终浓度为0.5ug/mL，黑暗环境下孵育5min后，分别曝光0、1、2、4、6、8、10min,处理后PCR产物电泳结果如图5所示。由图5可以看出只有不曝光的有条带，其他均无条带，说明EMA处理后，曝光1min，即可使EMA与死菌充分交联。

bp20001000750bp20001000750500250100图5曝光时间注：M：Marker；1:0min；2：1min；3：2min；4：4min；5：6min；6：8min；

7:10min；8：阴性对照PCR方法的敏感性用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的阪崎肠杆菌菌落转接于5mL灭菌去离子水中，用比浊仪调至0.5MCF,系列稀释至10-1-10-8，以此为模板，按上述方法进行EMA-PCR试验，同时对检出的最低稀释度进行涂板计数，每个稀释度做3个重复，37培养24h,检测PCR反应灵敏度。结果表明，建立的PCR方法检测限是1.0X102cfu/mL（图6）。2000100075020001000750500250103M1234567S9图6PCR敏感性检测注：M：Marker；1：阴性对照；2：10sCFU；3：107CFU；4：106CFU；5：105CFU；6：104CFU；7：103CFU；8：102CFU；9：10CFU；10：1CFUPCR方法的特异性将阪崎肠杆菌标准菌株及其余待测菌株单菌落分别接种于LB肉汤中过夜培养，取菌液作为PCR反应模板，按上述方法进行试验。结果如图7,由图可以看出以阪崎肠杆菌标准菌株为模板PCR产物出现有1条特异性的932bp条带，与预测序列片段大小相符；阴性对照、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等12株非阪崎肠杆菌菌株未出现任何扩增条带；同时也未发现有其他非特异性扩增条带，表明建立的PCR方法具有很高的特异性。20001000750S002501QQ20001000750S002501QQM1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14图7PCR特异性注：M：Marker；1：阪崎肠杆菌ATCC295442：阴性对照；3：甲型副伤寒沙门氏菌；4：鼠伤寒沙门氏菌；5：猪霍沙门氏菌；6：肠炎沙门氏菌；7：志贺氏菌；8：福氏志贺氏菌；9：宋内氏志贺氏菌；10：鲍氏志贺氏菌；11：金黄色葡萄球菌；12:大肠杆菌；13:单增李斯特氏菌；14：肠致病性大肠杆菌5•结果报告凡被检样品的PCR扩增产物电泳结果在932bp处出现一条目的条带（见图8）,即可报告该样品中检出阪崎肠杆菌。bp20001000750500250100图8阪崎肠杆菌活菌