NY-T 4362-2023 饲料添加剂 角蛋白酶活力的测定 分光光度法

ny/tny/t1362—2023ICS65.120ICS65.120CCSB46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T4362-2023饲料添加剂角蛋白酶活力的测定

分光光度法Feedadditives Determinationofkeratinaseactivity—

Spectrophotometricmethod2023-08-01实施2023-04-112023-08-01实施中华人民共和国农业农村部发布刖 本文件按照GB/T1.1 2020«标准化T作导则第1部分：标准化文件的结构和起单规则》的规定起草，it注意本文件的某些内容吋能涉及专利。本文件的发布机构不承拉识别专利的责任。本文件由农收农村部备牧&医局提;IL本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)!IJU。本文件起草单位：中W农业科孕院饲料研究所、山东降科特酣制剂冇限公司、福建倣农生物科技集W股份有限公司、广州立达尔生物科技股份有限公司.本文件主要起孕人，丁宏标、钱娟娟、侯玉煌，周盛M、陶正国，李4龙、刘胜利。ny/tny/t1362—2023II饲料添加剂角蛋白酶活力的测定

分光光度法1范围本文件描述r饲料添加剂角蛋白酶活力的分光光度测定方法。本文件适用于饲料添加剂角蛋白酶产品中酶活力的测定。本文件的方法定最限为100U/g(U/mIJ。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注□期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件》不注日期的引用文件.K最新版本(包拈所有的修改单)适用于本文件》(；B5009.5—2006食品安全国家标准含品屮蛋闩质的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制蓓3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3.1角蛋白酶keratinase产自地衣芽孢杆菌.可以降解羽毛等动拉物角蛋白生成氨堆酸或肽类的蛋fl酶。3.2角蛋白酶活力单位keratinaseactivityunit在40X：、PH8.0的条件下.水解酪蛋闩，每分钟产生IPg的酪衩酸的解S为一个酶活力单位，注：单传为LL4原理在一定的温度和pH条件下.角蛋白酶水解酪蛋白底物产生含有酚基和吲哚基的氨基酸.用氯乙酸沉淀后，在碱性条件下，将描林试剂还原，/|:成磷钨钼般.在680nm有辰大吸收.K颜色的深浅与酚基氨基肢含呈成正比。采用分光光度法测定反应液吸光位.计算角蛋白梅活力。5试剂或材料除非另有说明.仅使用分析纯试剂。1水：GB/T6682,三级。5.2碳酪钠溶液(0.4mol/L)：称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL，混匀。3三氯乙酸溶液(0.4mol/L):称取-氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL,混匀.4盐酸溶液(1mol/L)：取浓盐酸85mL.加水稀释并定容至1000mL,混匀。5.5盐般溶液(0.1mol/L)：flit10mL1mol/L盐般溶液(5.4).定容至100mL.混匀。56氢氧化钠溶液(0.5mol/L)：取氢氣化钠20.0g.用水溶解.冷却至室温后定容至1000mL.混匀。5.7福林(Folin)试剂：于2000ml磨口回流装S中加人钨般钠(NaW(>4•2H0)100.0g、钼般钠

(Na2MoO:•2H,())25.Og.水700mL,85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h,取下回流#ny/t4362—2023附泉A(规范性)角蛋白酶鉴别试验A.1原理角蛋门解作用于不溶于水的羽毛粉生产可溶于水的氨堪酸或肽类物质，经与同规格的屮性蛋门酶、喊性蛋白梅进行羽毛粉降解后的比对，通过凯氏记氮法对溶液屮的筑含量进行比较，可定性判定是否为角蛋白阅。A.2试剂或材料除非另有说明.仅使用分析纯试剂。A.2.1水:GB/T6682.三级,A.2.2硼酸钠溶液：称取3.80g硼酸钠(硼砂〉，加水溶解并定容至1000mL,混匀。A.2.3硼酪溶液：称取12.37K硼酸.加水溶解并定容至1000mL,混匀.A.2.4硼酸缓冲溶液(pH8.0)：取50mLffl酸钠溶液(A.2.2).用硼酸溶液(A.2.3)将pH调至8.0±0.备ffl。A.2.5羽毛粉，收集家禽羽毛.蒸馏水消洗干净，用70%的乙醇浸泡1h后，105X：干燥4h烘至恒重，用粉碎机粉碎1min.待用。A.2.6角蛋內酶稀释液：称取角蛋内酶0.1g〜1g.精确至0.0001g,加人ffl胺缓冲溶液(A.2.4)稀释至10000U/mU如角蛋白酶为液体试样，吸取0.1mL-1.0mh稀杼至10000U/mL.待用。A.2.7碱性蛋白酶稀释液：称取碱性蛋白酶0.1g~lK,牾确至0.0001fj,加人硼酸缓冲浴液(A.2.4)稀择至10000U/mL。如喊性蛋白梅为液体试样.吸取0.1mL-1.0mL稀择至10000U/mL.待用。A.2.8中性蛋白酶稀释液：称取中性蛋白酶0.1g~lg.栢确至0.0001g.加人硼酸缓冲溶液(A.2.4)稀释至10000U/mL.如屮性蛋白梅力液体试样，吸取0.1mL~1.0mL稀释至10000U/mL.待用。A.3仪器设备A.3.1恒温水浴：枯度为土0.2V'。A.3.2恒温T燥箱：精度为±1V，A.3.3万能粉碎机：25000r/min.A.3.4A塞比色管：25mL.A.4试验步骤A.4.1羽毛粉降解分别准确称取0.10g羽毛粉于3个25mL的:H塞比色竹中.分别向3个比色竹中加人10000U/mL的角蛋1'1酶稀释液＜A.2.6)20mL、緘性蛋A酶稀释液(A.2.7)20mL、中性蛋fI酿稀释液(A.2.8)20mL,摇匀后S于40t水浴中反应24h。24h后取出3个具塞比色管，用定性滤纸过滤，分别取滤液2.0mL分别进行蛋白质含M测定。测定结果分别为注：当角蛋A曲样品活力＜50000u./g时，可以适内增人稀择倍数，角蛋A酶，喊性蛋A»、中性蛋白酶可