培训课件-04培训

低，主要用来制备纯血粉或发酵血粉。其中牛血占了很大的比例，但是都难以形成产业化。本第一节牛血的基本知识血液由液体部分血浆和悬浮在液体内的有形成分组成。如果将牛全血放在试管内，用抗凝血剂或其他方法处理，以防其凝固，则静置一段时间或用离心机沉淀分离后，就可看到试管中层之间可以看到一层薄薄的白色物质，这一层是白细胞和血小板。牛的全血中水分约占80%,干物质约占20%。其中血浆约占60%,血细胞约占40%。血浆中含水分90%~92%,干物质8%~10%。血浆中的干物质主要由蛋白质和盐类所组成(见表4-1)。血浆蛋白质包括清蛋白、球蛋白、纤维蛋白原三种，约占血浆总量的6%~8%。纤维蛋白原在血血浆中还含有一些无机盐，其含量在正常条件下比较恒定，约占0.9%。此外，血浆中还含红细胞是血液中的主要组成部分，它是红色和圆形的球体，红细胞中水分约占60%,干物质约占40%。干物质中主要为血红蛋白，占90%;其余10%为其他蛋白、类脂质、葡萄糖和无机盐。白细胞是无色、有核的球体，体积比红细胞大，数量比红细胞少得多。白细胞含有普通细胞的成分，如蛋白质、核蛋白、脂类、卵磷脂、胆固醇、酶和无机盐，并有相当多的蛋白酶。血小板是一种小而无核的不规则形小体，其主要机能是参与血液的凝固过程。表4-1血浆干物质的组成刚从牛体流出的血液为红色不透明微碱性的液体，稍带黏性，有咸味和特殊臭味。牛的血量是比较恒定的，一般约占体重的8%。在正常生理条件下，只有一部分血液在血管内循环，另一部分贮藏在血库中。脾脏、肝脏和皮肤都是血库。据测定，脾脏约贮存有总血量的16%,肝脏约贮存有20%,皮肤内约贮存有10%。所以循环的血液大约占全身总血量的一半。因此，从血液的实际可被利用量来说，牛血的采出率仅占体重的5%。(一)牛血的凝固牛的血液从血管或放血口流出来附是液态，如果静置不动、约经5-10分钟后，呈现胶状的变化过程。发生这种变化的根本原因，是由于血浆中呈现溶解状态的纤维蛋白原，转变成不溶解的纤维蛋白。纤维蛋白形成后，在血液中构成构密的细纤维网，把所有的血细胞都维绕在一起，因而使原来呈液体状的血液逐渐变成胶冻状的血块。血液凝固后，由于血小板成堆地粘聚在纤维蛋白丝上，使纤蛋白丝渐渐缩短，因而使血块变硬，并从血块中挤出血清。(二)牛血的比重牛血的比重因性别不同而异，公牛全血的比重为1.06;母牛全(三)牛血的酸碱度牛血呈弱碱性，pH7.3-7.5,一般血液的酸碱度是指血浆的pH,血细胞的pH约为7.1身有缓冲功能，即使不断增加碳酸，仍可保持7.4左右。(四)牛血的黏滞度血液的黏滞度是根据与纯水的黏滞度作比较而确定的。如以水的黏滞度为1,则全血的黏滞第二节牛血的采集和保藏一、牛血的采集即将已击晕的牛沿颈横割，切断全部颈部血管而放血。第二种是将牛倒放在地板上，在颈静脉沟处作一切口，切断一侧的颈静脉和颈动脉，屠刀通过胸腔前口向里插入，在两颈动脉的接合处切断前主动脉而放血。第三种是仅割断颈部的血管，即两侧的颈静脉和颈动脉放血。小型企业或简陋居宰场，没有现代化设备，也不能保持卫生。因此，血液采集卫生就成为问题。如将牛倒置在地板上署宰，很难采集到清洁的血液，污染或损失是不可避免的。为了解决这个问题，可用直径为50厘米，深为10-12厘米的盆来采集血液。这种盆一端安有一个流出嘴，另一端有一个手柄。而无论制造何种血产品，采集的血液必须避免污染。常见的污染物有在放血的最后阶段牛吐出的食物；屠宰场地板上飞溅的粪便或污水；加工过程中所利用的冲洗水。所以，采集血液后应当场检查，避免污染。在卫生条件较好的屠宰场，实行电击晕屠宰，采集血液的容器因加工目的不同而不同，如加工血粉可用塑料容器，如需使血液凝固，贮放容器可以是圆筒型或箱型，脱纤维蛋白血或抗凝剂的血，应存放在奶罐型的容器中，用不锈为了防止腐败，采集的血液要尽快运往加工厂，特别是夏秋季节，为避免血液在途中温度升高，运输时间最好安排在夜间或早晨，或用隔热材料遮盖容器。同时，血液必须在密闭容器刚从牛体放出的血液为红色不透明液体，如果不采取任何措施，很快就会变暗，并随之形成凝块。某些产品的制取原料必须是液态血，也就是加入抗凝剂的血液。常用的抗凝剂有：1、草酸盐常用的有草酸钠和草酸钾。每升血液(1升血液约1千克重)加入草酸钠或草酸钾1克，以其30%的水溶液加入血中：或用0.6克草酸铵与0.4克草酸钾，以少量生理盐水稀释后加入1升血内。草酸盐的抗凝作用，是由于草酸盐能使血液中的钙离子沉淀，从而防止血液的凝固。加工食用血产品或制取医用血产品，禁止使用草酸盐，因为草酸盐有毒。2.柠檬酸钠每升血液加入柠檬酸钠3克，以其少量水稀释或较大量生理盐水稀释后加入血中。柠檬酸钠能将血液中的钙转化为非离子态，从而起到抗凝作用。在食品工业和医药工业方面，柠檬酸钠的使用法规各不相同。因此，应用时应先查清有关法规。3.乙二胺四乙酸(EDTA)乙二胺四乙酸的二钠盐作为抗凝剂，是以每升血液加入2克的比例，先稀释于少量水中或大量生理盐水中，然后再加入血内。乙二胺四乙酸的抗凝作用，是通过络合血液凝固所需的钙离子而起作用。绝大多数国家允许在食品工业和医药工业中使用乙二4.肝素肝素是最理想的抗凝剂之一，商业上最常见到的是肝素的钠盐、钙盐和钾盐。应用时，每升血液加入200毫升肝素。肝素有抑制血致活酶和凝血酶的作用。因此，能阻止血液的凝结。肝素抗凝液态血是食品加工和医药制造的原料。抗凝剂最好以固体盐的形式贮存，使用前配制成溶液。抗凝剂溶液有毒，尤其是肝素，绝不能与食品接触，为了使用安全，抗凝剂溶液应贴标签，并用食品所允许的染料轻微染色，以抗凝剂的使用方法，是在采集血液后的2-5分钟内血液尚未凝固前，根据血液的容积计算出应加的抗凝剂数量，或计算出应加的预配抗凝液容量，然后缓缓加入血液中，并搅拌均匀。制取液态血除添加抗凝剂外，也可以用人工方法脱出血液中的纤维蛋白的方法，适合于中小型加工厂或屠宰场应用。方法是：将牛体刚放出的血盛入容器内，用表面粗糙的木棒或长柄漂浮在血液表面上，这样就可以将纤维蛋白与液态血分离。当把脱纤维蛋白的血液灌入另一容器时，经过过滤，纤维蛋白即可沥出。被脱去纤维蛋白的血液，保持其液态特性，在进入下一在人工搅拌脱血纤维蛋白时，可从血液中得到12%左右的血液纤维蛋白，收集到容器中，藏15天左右。第三节牛血的加工与利用一、饲用血粉的加工(一)牛血粉的营养价值牛血粉含粗蛋白质80%以上，含干物质82%-85%,含水分5%~8%,并含有多种维生素和微量元素，是配合饲料中很好的动物性蛋白质和必需氨基酸的来源。配合饲料中加入适量血粉，可以获得满意的生产结果。据测定，血粉中粗蛋白质对于鸡的消化率为87%,粗脂肪的消化率为90%。而且用血粉喂鸡，其赖氨酸的利用率高于鱼粉、大豆饼和脱脂奶粉。饲养实践中使用的血粉产品，有血粉和骨肉血粉，多用于鸡、猪的动物性蛋白质补充料，喂饲量一般为配合饲料的5%,雏鸡则为3%。(二)牛血粉的加工工艺1.血液的采集与处理饲用血粉是用于饲喂家畜、家禽的产品，所以必须保证血液在采集过程中不被污染，尤其要防止冲刷地板的污水及其他外来物质的污染，因其中很可能含有洗涤剂、杀菌剂、杀虫剂残余，以及寄生虫虫卵、细菌孢子等。当血液干燥，这些残余物质将会出采集到的血液最好当天进行加工，以防腐败。如果不能及时加工，可以全血中添加0.5%-1.5%的生石灰，并不断搅拌直至血液凝固。凝固后的血液呈胶体韧性，不粘附容器，可以保存2.凝血的蒸煮将凝固牛血用刀划成10厘米大小的立方块，放入双煮器中蒸煮，使其继续凝固。用双煮器较理想，但会增加燃料成本和设备费用。也可用其他容器以直接在火上煮，但会使部分凝血炭化。利用大型浅盘状容器蒸煮，可使炭化减少到最小程度。蒸煮时，先在容器 (或锅)内放入适量清水，加热至沸腾，再将凝血块倒入容器中，水即停沸，此时要注意不可使水再沸，否则凝血块即行散开，呈泡沫状，损失很大。在不沸的水中约煮20分钟左右，凝血块内部颜色变深，而且内部和外部都已凝结，即可取出将水沥干。煮过的血块可放入麻布袋或其他针织袋中，压迫脱水，然后再挂起来冷冻脱水；也可以放在压榨机上压出水分，经过上述任何一种方法脱水后，血块的水分含量降低到50%以下。3.凝血的干燥凝血干燥简便易行的方法是日光照射。将蒸煮过的凝血块弄碎，均匀撒在苇席、竹匾，或铺于地面上的暗色塑料薄膜以上时，约经2~3天可完成干燥过程。在相对湿度高于50%的地区，白天摊开暴晒，晚上推成堆，用塑料薄膜覆盖，以避免吸潮而损失。如果生产规模较大，有条件，蒸煮血块也可以在高压热气循环炉中以60℃干燥。4.干血的粉碎干燥后的凝血呈易碎的小块，可用石磨磨碎，或用粉碎机粉碎成细粒，即5.血粉的贮藏血粉可用塑料袋、厚纸袋、麻袋或其他适合的容器包装。未添加石灰的血粉仅能保存4周，而添加石灰后的血粉保存期可延长到一年以上。目前有许多血粉进口国，强制要求血粉在包装前放入干燥器内以100℃,持续30分钟消毒，养完全冷却后，装入密图容器或塑料袋中；或用环氧乙烷照腾腾孝，消毒后的产品须保存在密图的容器中。二、工业用血粉的加工工业用血粉又称喷雾干燥血或黑血蛋白，星深红褐色粉状。含水分5%-8%,灰分10%-15%,(一)工业用血粉的用途工业用血粉的用途很广，胶合板工业中用作粘合剂；皮革工亚中用作蛋白质抛光剂：防清乳胶中作为稳定剂：陶瓷制品中作为泡沫稳定剂和分解过氧化氢的催化剂；也是杀虫剂和杀真菌剂的稳定剂，扩散剂和粘着剂；此外，在畜禽配合饲料中，既可作为动物性蛋白饲料，又可(二)工业用血粉的加工工艺1.原料血处理加工工业用血粉的原料血为脱纤维蛋白血。脱纤维蛋白血的制取方法，已在“血液的防凝”中叙述，这里不再重复。制备好的脱纤维蛋白血应在几小时内进行加工，如暂不能加工，须置于4℃条件下贮存。脱纤维蛋白血在喷雾干燥前必须过滤，除去血纤维蛋白和杂质。可用滤血池(图4-1)过网放血口，B、C池之间也有一个过滤网放血口。当脱纤维蛋白血经入口处进入A池，再从A池流入B地时，残存的血纤维蛋白被滤过网阻止于A池一侧，血浆则继续从B池流入C池，这时又有一小部分血纤维蛋白留在B池内。在C地安装有4号管道和4号离心泵，用5马力电动机带动。接通电源后，可将C池中的血浆由管道输送到贮血池中。图4-1滤血池平面图贮血池(图4-2)用水泥制成，池长3米，宽1.9米，深2.5米。池壁上设一标尺，随时可查看池中原料血的数量。在贮血池的上部装有过滤器，是用铁丝网制成，血浆由滤血池经管道注入贮血池时，先过滤一次，使血浆更加洁净。在贮血池的另一边装有1号离心泵1台，由1号管道将血浆输送到贮血槽，用血泵通过管道，将血浆压送到喷雾干燥设备的干燥塔顶部，待喷2.喷雾干燥血浆的喷雾干燥是通过一套工业用喷雾设备来完成的，由贮血池送到干燥塔顶部的血浆，通过设在该部的喷嘴呈雾状向下喷出。喷出的雾状液体在喷嘴处与热空气进行交换后，水分被空气带走，血液干物质就以细粉状落下，在干燥塔底部沉积。热空气在入口温度为200~250℃,出口温度近70℃。喷雾干燥完毕后，先通空气冷却血粉到室温，然后再进行包3.包装和贮藏为了便于销售和使用，工业用血粉一般为1千克、2千克和5千克的小包装。包装袋通常为聚乙烯袋，也可用其他防水容器。如果包装合理，可贮藏5年之久。(三)牛血粉的质量标准细粉状血粉的质量标准，包括物理指标和化学成分指标。1.物理指标(不分级)外形：通过2毫米筛的细粉；2.化学成分指标(分级)列于表4-2表4-2血粉的化学成分指标微生态血粉是利用动物血液，经发酵而制成的具有营养和保健双重功能的血粉。其生产工(一)原辅材料牛血液；菌种，主要有蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌、啤酒酵母。(二)加工方法1.血液处理收集常规屠宰血液，自然凝固后称重，每1千克鲜血各加入0.2千克玉米粉、麸皮、大麦芽粉和米糖，混合搅拌成半固体匀浆。2.血液发酵鲜血加载体吸附后的半固体匀浆→蒸汽灭菌熟化→冷却后接种蜡样芽孢杆菌和枯草杆菌培养40~42℃,18小时，接种嗜酸乳杆菌和粪链球菌培养液培养40~42℃,18小时接种啤酒酵母菌培养液培30~32℃,培养24小时，→血液发酵物。3.血粉制作血液发酵物→45℃烘干→粉碎→过筛→成品血粉。血清是血浆分离出纤维蛋白后的产物，为淡黄色透明液体。公犊无菌血清则是在无菌操作公犊无菌血清可作为生物实验室的标准蛋白质溶液；也可作为病毒繁殖培养基的组分；生产病毒疫苗时作为细胞生长培养基的组分；该产品也用作某些微生物的培养基。需要利用无菌血清的单位很多，如医学、生物学、农业科学研究院；医科、农业大专院校，生物制品研究所、生物药厂、卫生防疫站以及县中心医院以上的各医院都需要。目前，许多乡镇办奶牛场、兽医站等，都在利用乳用公犊牛制取无菌血清，每头公续可制得600-800毫升粗制血清，获净利20元左右，如果取精制血清，经济收益还可大大增加。(一)制取工艺1、原料血采集应采取初生24小时以内未吸吃乳汗的健康乳用公犊的全血。血液采集要严格注意卫生，必须无菌操作，装血容器最好是玻璃制的或不锈钢制的，用前要彻底清洗，并采血的方法，将公渎采用仰卧保定，在一侧颈静脉处用喷图消毒，切开静脉，插入引流玻璃管。玻璃管指向心部，将玻璃管与血管一起结扎。然后，放开止血钳，将血液引流人消毒容血液采集后，让其自然凝固，要及时遮盖，防止污染，最好放入冰箱内，避免过度振荡，2.血清制取将冷冻凝血块用锋利刀片切成1-2厘米的小方块，然后在5~10℃的冷室中，将凝血块放在布氏漏斗中，血清在布氏漏斗中逐渐析出，并流入锥形瓶内。最初2~3小时收集的血清颜色较深，应废弃，在12小时内收集的血清用吊桶式离心机离心，以200~250克(用带有250毫升离心瓶的MSE离心机，每分钟1000~1500转)离心30~40分钟，然后收集透明的淡黄色上清液(血清)供失活。血清的失活是以54~56℃的温度下，在双煮器中容纳30分钟，再在高压灭菌锅中，以0.13MPa压力消毒20分钟，最后再在Seitz式过滤器中进行过滤，将滤液装入50毫升或100毫升的无菌安瓶中，每一安瓶应贴上标签并注明制造日期，如公犊失活无菌3.血清的贮藏在4~5℃下安瓶装血清最多贮藏1个月；在-20℃下可贮藏6个月，在-40℃下则能贮藏1年。如果准备深冷冻贮藏，在装安瓶时要留有一定空间，避免冷冻时血清糖胀，4.无菌检验所制的公犊无菌血清应抽样进行无菌检验。方法是将5毫升血清接种到肉汤培养基和厌氧培养基中，培养3天后，应无菌生长，若血清已被细菌污染，则必须废弃。细菌5.粗制公渎血清的制取如缺乏上述有关仪器设备，也可加工粗制血清供使用单位自行精原料血采取的要求和方法同上，经无菌采血后，在室温内平衡2小时，再移至5~10℃下静置5小时以上，以析出血清，并通过虹吸作用将上层清澈的淡黄色血清吸出，注意不要与血细胞相混；凝血块静置后，也可用离心机以每分钟3000转，离心30分钟提出血清。然后将血清(二)注意事项制取公犊血清时应注意：从采血到分装安瓶，每道工序都必须严格遵守无菌操作；所用仪器设备和容器都要高压消毒；为防止出现红色血清，可在采血用玻璃容器中加入少量生理盐血酪素是用脱纤维蛋白的血浆，经加酸、压榨、干燥而制成的深棕黑色粉末状或颗粒状产物。本产品可作产塑胶，用于制作各种电器零件、容器把柄，以及充作钮扣原料。制取方法：将100千克脱去纤维蛋白的血浆注入耐酸缸内，以人工或机械搅拌。在搅拌过程中，徐徐添加14千克20%的硝酸，并持续搅拌1小时，在以后的6小时内，每隔30分钟搅拌3~5分钟。这时血酪素就由溶液中沉淀下来，然后装入布袋中滤去部分水分，放在竹匾或竹席上，日光晒干即成。在冬春季节阳光不足或阴雨天，须放入干燥室烘干，温度控制在45~50℃,并经常翻动，以便于干透。超氧化物歧化酶(SOD),简称SOD(superoxidedismi-tase),是一种广泛存在于动、植物及微生胞的细胞浆内，分子量在32000左右，由两个豆基组成，每个亚基含1个铜和1个锌。第二种亚基组成，每个亚基各含1个锰；来自真核细胞线粒体的Mn-SOD,由4个亚基组成，分子量约为80000。第三种类型，Fe-SOD,呈黄色，只存在于真核细胞中，分子量在38000左右，由两个亚基组成，每个亚基各含1个铁。此外，在牛肝脏中还存在一种Co.Zn-SOD。自从1973年Weisiger等在鸡肝脏中发现两种超氧化物岐化酶以来，至今已采用了各种分离及分析方法，成功地从各种动物肝脏及血液中，分离纯化了超氧化物岐化酶。同时发现超氧化物岐化酶的存在可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐射防护等有关。目前临床上主要用于延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症，无抗原性，毒副作用较小，是很有临床价值的治疗酶。超氧化物岐化酶不仅在临床上大显身手，而且近年来又被广泛地应用于日用化工行业。含有超氧化物岐化酶的化妆护肤品，对抗衰老及去除脸面雀斑等有显著作用。添加超氧化物歧化酶的化妆护肤品倍受女士的青睐，其产品具有很强的竞争力。如市场上销售的奥琪、大宝、紫罗兰、永芳等高级护肤化妆品，都因添加了超氧化物岐化酶而成为抢手货。随着超氧化物歧化酶被广泛应用于护肤霜、洗面奶、香皂等领域及活性氧、疾病诊断和抗辐射等方面的研究，超氧化物岐化酶将成为广大药厂和日用化工厂的重要原料。目前我国大规模生产超氧化物岐化酶的厂家屈指可数，市场需求量大，在今后一段时间内供应将趋紧。因此，充分利用动物废弃物，生产超氧(一)原料及试剂1.牛血血液一定要保证新鲜，无污染。2.氯化钠这里用于配制生理盐水。选用一级工业品。4.丙酮这里作溶剂用，选用工业丙酮。5.氯仿又称三氯甲烷。无色透明易挥发的液体，稍有甜味，相对密度1.49,沸点61.2℃,不易燃烧，微溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、石油醚等。在光的作用下，能被空气中的氧氧化成氯化氢和剧毒的光气。这里用作溶剂，选用化学纯试剂。(1)2.5微摩尔/升磷酸氢二钾溶液的配制一般市售化学试剂其分子0.569克溶解在1000克蒸馏水中，搅拌均匀。(2)2.5微摩尔/升磷酸二氢钾溶液的配制如市售的化学试剂分子式为KH2PO4,则在1000克蒸馏水中加入0.34克，搅拌均匀。如果分子式为KH2PO4,.2H2O,则在1000克水中加入0.43(3)缓冲溶液的配制按上述方法配好2.5微摩尔/升磷酸氢二钾溶液和2.5微摩尔/升磷酸二氢钾溶液后，将磷酸二氢钾溶液缓慢地倒人磷酸氢二钾溶液中，直至调整溶液的pH至7.6为止。(4)50微摩尔/升磷酸氢二钾一磷酸二氢钾缓冲液的配制按照(一)6.之(1)~(3)项进行，只是分别将磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的量加大20倍即可。7.二乙胺乙基葡萄糖凝胶离子交换剂(DEAE-SephadexA-50)具有离子交换和分子筛的双重作用。其结构多孔、疏松，非特异性吸附很少，层析流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化以及生化制剂的热原。二乙胺乙基葡萄糖凝胶离子交换剂是一种阴离子交换剂，各地生化试剂商店均有出售。用前应预先处理，首先溶于水中(或5~10倍量洗脱剂中),最好将干胶往水里加，边加边搅拌，以防凝胶结块。在室温放置，完全水化后，再用水反复洗3~4次，同时沥去水面上漂浮的细粉，用抽气漏斗抽干。将抽干的胶浸泡于0.1摩尔/升的氯化氢溶液中20分钟，滤去氯化氢溶液，用水洗至中性。再用0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液浸泡20分钟，滤去氢氧化钠溶液，用水洗至中性。最后再用0.1摩尔/升氯化钠溶液浸泡20分钟，滤去酸液，用水洗至中性，然后用磷酸缓冲液浸泡平衡即可使用。交换剂使用多次后吸附量降低，可按上述方法处理一遍，以保证交换剂的交换能力(二)超氧化物岐化酶的提取工艺1.超氧化物岐化酶提取的工艺流程见图4-3。(1)分离血细胞取新鲜牛血，按100千克牛血加3.8克柠橡酸三钠投料，搅拌均匀，装入离心管中，在离心机中以3000转/分的速度离心15分钟，收集血细胞，血浆可用于制备凝血(2)提取把收集的血细胞用0.9%氯化钠溶液洗三遍(每次用血细胞2倍体积的氯化钠溶液),然后加入蒸馏水(和牛血等量的水),在0~4℃条件下，搅拌溶血30分钟，再缓慢加入溶血的血细胞0.25倍体积的95%乙醇和0.15倍体积(相对于溶血的血细胞而言)的氯仿(乙醇和氯仿要事先冷却至4℃以下),搅拌均匀，静置20分钟，置离心机中离心30分钟，收集上清图4-3超氧化物岐化酶提取流程图(3)沉淀在上清液中加入2倍体积的冷丙酮，搅拌均匀，于冷处静置20分钟，离心收集沉淀。沉淀物用1~2倍体积的水溶解，在55℃水浴中保温15分钟，离心收集上清液。再用2倍冷丙酮使上清液沉淀，静置过夜。然后离心收集沉淀，上清液可回收丙酮。K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，用离心法除去杂质，收集上清液准备上柱。先把二乙胺乙基葡萄糖凝胶离子交换剂装入3厘米×40厘米的柱中(即柱长40厘米，柱内径3厘米),用pH为7.6,2.5微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液上柱，等流出液的pH为7.6时，然后将样品上柱，用pH7.6,2.5~50微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液进行梯度洗脱(洗脱液浓度从2.5微摩尔/升开始逐渐加大至最终浓度达50微摩尔/升，这样便形成一个洗脱梯度),收集具有超氧化物岐化酶的活性峰，将洗脱液倒入透析袋中，在蒸馏水中进行透析(透析方法是利用小分子物质在溶液中通过透析袋，而蛋白质和黏多糖等大分子不能通过透析袋的性质而达到不同大小分子分离的一种方法),然后将透析液经过滤浓缩后，冷冻干燥即为超氧化物岐化酶产品。凝血酶是机体凝血系统中的天然成分，由两条肽链组成，多肽链之间以二硫键相连接。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在一定条件下凝血酶被激活并转化为有活性的一种蛋白质水解酶。分子量335800,白色，无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。目前国内主要从牛血浆及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲广大用户欢迎，将广泛应用于临床。由于临床使用该药日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺。因此，生产前景看好，只要原料有保证，技术过关，就可获得产品。1.血液需选用新鲜的牛血液，防止混入其他杂质。盛血液的器具一定要干净。1.857,150℃时失去结晶水，温度3.醋酸学名乙酸。无色澄清液体，有刺激气味，相对密度1.049,沸点118℃,溶于水、乙4.氯化钠白色立方晶体或细小结晶粉末，相对密度2.165,熔点801℃,味咸，中性，有杂质时易潮解，溶于水和甘油，难溶于乙醇。选用一级工业品。5.氯化钙白色立方晶体，易潮解，相对密度2.15,熔点782℃,沸点大于1600℃,溶于水、乙醇。本工艺中用作激活剂，选用分析纯试剂。6.丙酮无色，易挥发、易燃液体。有微香气味，相对密度0.7893,沸点56.5℃,与水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶，能溶解油、脂肪、树脂和橡胶。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物，化学性质活泼。本工艺中用作沉淀剂，选用化学纯试剂。7.乙醇又称酒精。无色、透明、易挥发、易燃的液体，有酒味和刺激辛辣滋味，相对密度0.789,沸点78.4℃,溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸湿性，能与水形成共沸混合物。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物。本工艺中用来洗涤凝血酶，选用工业乙醇。8.乙醚又称二乙醚。是易流动的无色透明液体，有令人爽快的特殊气味，其蒸汽能使人失去知觉，甚至死亡，相对密度0.7135,沸点34.5℃,难溶于水，易溶于乙醇和氯仿等溶剂，极易挥发和着火，与空气组成的混合物极易爆炸。常用作溶剂和麻醉剂。本工艺主要用于洗涤凝血酶，选用化学纯试剂。使用时，操作人员应注意防护，避免吸入，周围应杜绝明火并保持空9.草酸钾又名乙二酸钾。这里用于测定凝血酶活性，选用分析纯试剂。10.标准纤维蛋白原这里用于测定凝血酶效价，选购药检部门提供的标准品。(二)凝血酶的提取工艺1.分离血浆，提取凝血酶原取牛血液，按每千克血液加3.8克柠檬酸三钠投料，搅拌均匀，装入离心管中，以3000转/分的速度离心15分钟，分出血细胞(可供制备血红素),收集血浆。把血浆溶于10倍的蒸馏水中，用1%浓度的醋酸调节pH至5.3,在离心机上离心15分钟，2.凝血酶原的激活在30℃条件下，将凝血酶原溶于1~2倍的0.9%氯化钠溶液中，搅拌均匀，加入占凝血酶原重量1.5%的氯化钙，搅拌15分钟，在4℃下放置1.5小时左右，保证凝3.淀淀分离凝血酶将激活的凝血酶溶液用离心机离心15分钟，弃去沉淀。上清液移入塘瓷桶中，加入等量的预冷至4℃的丙酮，搅拌均匀，在冷处静置过夜，然后用离心机分离，收集沉淀，上清液可供回收丙酮。沉淀用丙酮洗涤并研细，在冷处静置3天左右，然后过滤，沉淀分别用乙醇和乙醚洗涤一次，放置在干燥器或石灰缸中干燥，即得凝血酶粗品。4.除杂，沉淀，干燥把粗品溶于适量(1倍左右)的0.9%氯化钠溶液中，在0℃放置6小时以上，然后用滤纸过滤，滤出的沉淀再用0.9%氯化钠溶液溶解，在0℃放置6小时以上，过滤，合并2次滤液，用1%醋酸溶液调节pH为5.5。然后离心，弃去沉淀，收集上层清液。在清液中加入2倍量预冷至4℃的丙酮，静置3小时，离心30分钟，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮中，静置过夜，然后过滤，沉淀分别用无水乙醇、乙醚各洗涤一次，干燥即得产品。(三)凝血酶效价测定1.标准纤维蛋白测定法凝血酶的单位定义为活度量，即1毫升标准纤维蛋白原溶液在28℃、15秒钟内产生凝集的量为一个单位。具体做法，将凝血酶样品配成适当浓度，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纤维蛋白原溶液，于28℃测定其凝结时间(先将凝血酶配成一定浓度，测得的凝结时间去除15,再乘以溶液浓度),得到每毫克样品所含单位的估算值。再按估算值配成0.2毫升含1个单位的凝血酶溶液，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纤维蛋白原溶液中，凝结时间为15秒。2.草酸盐牛血清测定法即1毫升草酸盐牛血清在28℃、15秒钟内产生凝集，则含凝血酶2.25单位。具体做法，1份牛血清与1份等渗草酸钾溶液(1.85%)混合，离心分离得草酸盐牛血清(-40℃只能保存2个星期)。取几只试管，各加0.9毫升草酸盐牛血清，依次加入不同稀释度的凝血酶样品溶液0.1毫升，通过反复试验，确定适宜的稀释度，使之在15秒钟内产生凝集。同前面的定义一样，在15秒钟出现凝集的试管含2.25单位凝血酶。估量稀释度后，很快就可确定凝血酶原液的滴定度及每毫升或每毫克凝血酶的单位。国外已有报道以牛血浆为原料制备凝血酶，原有的凝血酶制备方法，获得的凝血酶效价最高约每毫克干重950单位，即每毫克氮约6600单位。沃尔特等报道，经过改进的凝血酶制备方法，其分离获得效价为每毫克氮约12000单位的凝血酶组分。并由溶解度曲线表明制剂含有两个明显不同溶解度的活性组分，它们的效价分别是每毫克氮10086单位及13365单位，从而推断凝血酶有两个活性组分，即存在两个天然凝血酶分子。采用一般方法制备的凝血酶，通常为灰白色粉末，将其溶于生理盐水中，通常得到的是半透明胶状悬浊液。这是因为含有杂质的缘故。若制备过程中采取了透析及硫酸铵进行分级分离等步骤处理，凝血酶的纯度将大大提高。其精品色雪白，极易溶于水，水溶液澄清透明，医疗价值更高。因此，根据需要，可制备凝血目前国际上仅有英、美、日等少数发达国家能在低温状态下，从人或牛血液中人工提取凝血酶，但因受其生产环境、血源等因素制约，其产量很小，远远满足不了市场需要，其产品主要用于生化制药产品的鉴定，很少直接用于临床，因其价格十分昂贵，很难被用户接受。当前我国凝血酶产品已应用于临床，但由于技术原因、原料分散等因素的制约，故产量也比较小，远远满足不了国内临床的需求。随着凝血酶应用的不断推广，用量迅速扩大。加之世界一些地区战乱，伤病人员增加，对高效局部止血药的需求量更难以估计，产供矛盾也将更为突出，市场价格有增无减，国内外市场前景相当广阔。凝血酶是以凝血酶原的形式存在于人或牛血液中，而我国人口众多，属于食肉大国，其牛血源均白白流失，成为污染环境的一大公害。提取凝血酶既可变废为宝，为国家创汇，又可解决环境污染问题，所以生产前景是乐观的。血红素是由原叶啉与一个二价铁原子构成的称为铁叶啉的化合物，具有很高的实用价值。在食品行业中，血红素可代替肉制品中的发色剂亚硝酸盐及人工合成色素。它可使肉制品产生一种诱人的鲜艳红色，增加其外观美感。如在西式方腿和红肠制品中添加血红素，其制品切面色泽均匀，鲜艳美观，保持肌肉固有的天然色彩，组织结构细密无空泡，口感韧性强，味道纯正，同时增加了营养价值。更重要的是使用血红素可减少亚硝酸盐的致癌作用。在制药行业中，血红素可作为半合成胆红素原料，而且是制备抗癌的特效药。另外，血红素在临床具备为补铁剂，可治疗因缺铁引起的贫血症(在儿童、妇女中较为常见)。目前临床上用的非血红素补铁剂，主要从植物性食物中提取，以氢氧化铁络合物形式存在。这种铁络合物在人体中吸收率很低，并含有对人体有害的成分。而血红素补铁剂(即亚铁血红素)可直接被人体吸收，吸收率高达10%~20%。我国民间早有吃血治疗贫血的经验，但原血有异味，易腐败变质，难以作为补铁剂用于临床。从血中提取血红素，可解决这一问题。血红素补铁剂将取代目前常用的补从牛血中提取血红素及血红素补铁剂，目前在国内外广泛引起人们的关注。牛血来源丰富。但不少地区，因原料分散，部分除食用外，都作废物弃去。因此，开发利用牛血具有很重要的经济价值。以往提取血红素一般用冰醋酸加热法，此法工艺流程长，效率低，成本高。从实践中人们总结出四种比较适用的方法，这些方法都是基于以下原理进行的。血液中的血红蛋白是由4分子亚铁血红素和1分子珠蛋白结合而成的。在pH小于3时，亚根据此性质，提取时先从血液中分离出血细胞液，然后加水将血细胞液溶解(即溶血),调节pH至3左右，加入适量丙酮，可使蛋白质凝固，亚铁血红素则溶于丙酮液中。此时若加入醋酸钠和揉酸，即可使血红素沉淀析出。如加入羧甲基纤维素(CM-C)阳离子交换剂，血红素可被羧甲基纤维素吸附，然后过滤，就可以分离出血红素。(一)原料及试齐2、醋酸钠无色、透明结晶或白色颗粒，相对密度1.45,熔点58℃,溶于水，稍溶于乙醇，其水溶液呈弱碱性反应。在干燥空气中风化，120℃时失去结晶水，温度再高即分解。这里3.柠檬酸三钠这里用作抗凝剂，选用化学纯试剂。8.氢氧化钠又名烧碱、火碱、苛性碱。纯品是白色、透明的晶体，相对密度2.130,熔点318.4℃。工业品中含少量的氯化钠和碳酸钠，是白色不透明的固体，有片状、块状、粒状和棒状等。吸湿性很强，易溶于水，同时强烈放热。它是一种强碱，对皮肤、织物、纸张等有强腐蚀性。这里选用一级工业品。配制溶液过程中，需使用耐碱腐蚀的容器，例如玻璃、陶瓷、塑料类容器，不可使用铁容器。操作人员需戴防护手套，溅于皮肤或衣物上时应及时用水冲洗。9.盐酸氯化氢的水溶液，纯品无色，工业品因含有杂质而呈黄色，浓度在36%左右，相对密度1.19,在空气中发烟，有刺激臭味。它是一种强酸，对皮肤、织物、纸张等有腐蚀性。这里用作pH调节剂，可选用工业品。稀释时所用容器及操作时的注意事项，同氢氧化钠。气味，有收敛性。见光或露置空气中，色渐变黑。溶于水、醇和丙酮，难溶于苯、醚和三氯甲烷。与蛋白质、淀粉、明胶、多种生物碱和金属盐类能生成不溶性的沉淀；遇铁盐则生成蓝黑色沉淀。应避光密封保存。这里用作吸附剂，选用化学纯试剂。11.吡啶(CsHsN)又称氮(杂)苯。无色或微黄色液体，有特殊的臭味，相对密度为0.9780,沸点115.56℃,溶于水、乙醇、乙醚、苯、石油醚和动植物油。是许多有机化合物的优良溶剂，并能溶解许多无机盐。有显著的但不是很强的碱性。可燃烧，其蒸汽与空气形成爆炸13.氨水分子式为NH3.H2O,它是气体氨的水溶液，有强烈的刺激气味，相对密度小于1,含氨越多，相对密度越小。一般工业品含量在20%~28%,主要用作液体肥料，也是一种重要的试剂，这里用作溶剂，选用分析纯试剂。(二)醋酸钠法提取1.工艺流程见图4-4。图4-4醋酸钠法提取流程图(1)分离血细胞、溶血将新鲜牛血移入塘瓷桶中，加入0.8%柠檬酸三钠(每100千克牛血加0.8千克),搅拌均匀，装入离心管中，以3000转/分的速度离心15分钟，弃去清液(可供提取凝血酶用),收集血细胞，加入等量蒸馏水，搅拌30分钟，使血细胞溶血。然后加5倍量(2)抽提在滤液中加4~5倍体积的丙酮溶液(其中含丙酮体积3%的盐酸),用1摩尔/升盐酸校正pH为2~3,搅拌抽提10分钟左右，然后过滤，滤渣干燥得蛋白粉，收集滤液备用。(3)沉淀将滤液移入另一塘瓷桶中，用1摩尔/升氢氧化钠调节pH为4~6,然后加滤液量1%的醋酸钠，搅拌均匀，静置一定时间，血红素即以无定形黑绿色沉淀析出，抽滤(或过滤)(4)干燥把血红素沉淀用布袋吊干，置于石灰缸中干燥1~2天，即得产品(也可用干燥器干燥)。(三)蒸馏法提取1.工艺流程见图4-5。图4-5蒸馏法提取流程图(1)分离血细胞将新鲜牛血放入塘瓷桶中，每100千克牛血加0.8千克柠檬酸三钠，搅拌均匀，装入离心管中，以3000转/分的速度离心15分钟，弃去上清液，收集血细胞。加入等体积的蒸馏水，搅拌30分钟，使血细胞溶血，再加5倍体积的氯仿，滤去纤维，收集滤液。(2)抽提把上述经除去纤维的血细胞移入另一塘瓷桶中，加4~5倍体积的丙酮溶液(其中含丙酮体积3%的盐酸),用1摩尔/升盐酸校正pH至2~3,搅拌抽提10分钟，然后过滤，收集滤(3)蒸馏将上述溶液装入蒸馏瓶中(装瓶体积为2/3),于水浴上蒸馏回收丙酮(温度控制在60℃左右),待滤液浓缩至干时，即有沉淀析出。倒入抽滤漏斗中过滤，收集沉淀。(4)干燥把沉淀抽干后，置于石灰缸中1~2天即得产品。产品为无定形黑绿色粉末状物，(四)鞭酸法提取1.工艺流程见图4-6。图4-6鞭酸法提取流程图(1)分离血细胞将新鲜牛血放入塘瓷桶中，加0.8%柠檬酸三钠，搅拌均匀，装入离心管中，以3000转/分的速度离心10分钟，弃去血浆，收集血细胞。加入等量蒸馏水，在0~4℃条件下搅拌30分钟，使血细胞溶血，然后加入1:5氯仿(即1份溶血液加入5份氯仿),过滤收集滤液(含血细胞)备用。(2)提取将血细胞滤液移入另一容器中，加4~5倍体积含3%盐酸的丙酮溶液，充分搅拌，搅拌抽提10分钟以上，过滤，收集提取液，滤渣经干燥得蛋白粉。(3)沉淀在提取液中加5%鞭酸，搅匀静置过夜，血红素呈针状结晶析出，离心分出血红素沉淀物，用蒸馏水冲洗3~4次，至洗出液变清，然后用布袋吊干。(4)干燥把干沉淀包好放入石灰缸中，干燥1~2天，即得血红素成品，装瓶保存。(五)羧甲基纤维素(CM-C)法提取1.工艺流程见图4-7。图4-7羧甲基纤维素(CM-C)法提取流程图(1)分离血细胞将新鲜牛血移入塘瓷桶中，加入0.8%柠檬酸三钠，搅匀后在离心机上以3000转/分的速度离心15分钟，分出血细胞，弃去血浆。(2)提取将血细胞移入另一塘瓷桶中，加3倍左右蒸馏水，搅拌30分钟溶血，用1摩尔/升盐酸调节pH至2~3,按血细胞液体积1:10或1:15的比例，加入羧甲基纤维素悬浮液，搅匀，静置3~4小时后在离心机上分出清液。(3)沉淀将分出的清液，用2摩尔/升氢氧化钠调节pH至5.5左右，静置沉淀分层，然后(4)干燥把沉淀物压干，置于60~70℃真空干燥，干燥后研磨，过0.177孔径筛，即得(六)冰醋酸法提取(1)提取先将牛血4倍体积的冰醋酸放入密闭的提取缸中，然后加大量新鲜牛血，加热至90℃,搅拌下恒温30分钟，然后室温静置过夜。(2)沉淀洗涤干燥，室温静置过夜后，缸中即有亮晶晶的沉淀物析出，然后滤出沉淀，沉淀分别用50%醋酸溶液、蒸馏水、乙醇、乙醚洗涤，即得粗品血红素。(七)血红素精制1.工艺流程见图4-8。(1)提取先将血红素4倍量的吡啶，7倍量的氯仿倒入瓶中，然后加入粗品血红素，充分振荡30分钟，过滤后收集滤液。图4-8血红素精制流程图(2)沉淀先把适量冰醋酸加热至沸腾后，加入各占1/7体积(相对干冰醋酸而言)的饱和氯化钠溶液和盐酸，随着加入滤液，搅匀后过滤，滤渣用氯仿洗涤，合并两次滤液，静置过(八)血红