饲料中胆汁酸的测定 编制说明

3《饲料中胆汁酸的测定》编制说明胆甾烷-24-酸;猪脱氧胆酸;异去氧胆酸、二羟基胆基酸;3β,6α-二羟基胆烷酸;臭微腥。略溶于醇，丙酮中微溶，乙醚、氯仿鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholicaci），羟基-5-β-胆烷酸，脱氧鹅胆酸；无色针状结晶。几乎不溶于水，易溶于乙醇、4两种类型。初级胆汁酸：在肝细胞以胆固醇为原料直接合成的胆汁酸，包括胆脱氧胆酸(优思弗)、TUDCA牛磺熊脱氧胆酸(滔罗特),亲水性胆汁酸对肝GCDCA甘氨鹅脱氧胆酸、LCA石胆酸(疏水性最强),疏水性胆汁酸具有细高露等人在以白羽肉鸡基础饲粮中添加300mg/kg的胆汁酸，在1~42龄期5马志茹等人[3]在欧洲鳗鲡幼鱼饲料中添加500mg/kg胆汁酸，结果发现胆汁酸可以降低欧洲鳗鲡幼鱼肝脏中脂肪合成酶水平和增加脂肪分解酶活性,上调肝脏磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱含量,主要增强甘油磷脂代谢和甘油酯代谢,对于胆汁酸(胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸)的检前衍生-高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、高效液相色谱电雾式检测器法、高效液相色谱蒸发光散射检测器法等[4-14]。2020年1月，中华人民共和国农业部公告第257号：根据《饲料和饲料添）；6合型饲料添加剂中胆汁酸的测定容量法》。该标准只能检测总的胆汁酸含量，荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知”78准方法设计合理，实用有效。液相色谱-串联质谱法的检出限、定量限、标准曲9（一）标准编制原则和分析效率为总原则，反映科学技术的先进成果和先程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部分总则》和GB/T2到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、准的内容便于检测机构和生产企业使用，并且易于关于胆汁酸检测相关的标准有团体标准《T/SDFA037-2023混合型饲料添加剂中胆汁酸的测定容量法》，上述滴定方法仅为胆汁酸总量的测定，无法区分质大多为水产品可食部分、药品和生物代谢物，对饲料中胆汁酸(胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸)的含量测定研究较少。饲料基质更为复杂，饲料基质有多大本文件描述了饲料中胆汁酸(胆酸、猪去氧胆酸2.2.3.1液质确证方法(1)质谱条件的优化胆酸、猪脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸分子结构见图1,三种化合物均含有羧基，更易丢失一个氢离子，故采用负离子模式。采用50%(v/v)甲醇水溶液稀释标(2)液相色谱条件的优化分别考察使用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相时3种化合物的峰型，如图2所示；当以甲醇和水为流动相时，色谱图如图3所示。经过比较可以发现，以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相时，胆酸峰型不好，猪酸和鹅去氧胆酸目标物质完全分离，并保证3个化合物的响应值均有提高，且图20.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相的色谱图图4乙腈水为流动相的色谱图时间(min)0）；图5胆汁酸(胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸)总离子色谱(TIC)图图7鹅脱氧胆酸标准溶液(100ng/mL)选择离子MRM色谱图图8猪脱氧胆酸标准溶液(100ng/mL)选择离子MRM色谱图(3)基质效应胆汁酸是一类强极性弱酸性化合物，胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸之间250x4.6mm、SUPELCODiscoveryHS-C185μm,250x4.6mm2种色谱柱的分离情况分离柱。AgilentEC-C184μm,250x4.6mm柱虽能较好的分开三个化合物，看音时间[min](2)流动相的确定水相的优化：高效液相色谱中流动相的配比是影响目标化合物分离的主要因素。试验比较了0.1%乙酸水溶液、0.1%磷酸水溶液和0.8mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(pH=3.0)为水相，乙腈作为有机相等不同流动相组合下，三种化合物的分离情况。实验表明在相同浓度下，0.1%乙酸水溶液-乙腈体系下，胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸虽能有效分离，但流动相干扰现象明显，无法达到10mg/kg的0.1%磷酸水和0.8mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(pH=3.0)作为水相可以增强胆汁酸在紫外检测器下的响应值。同时考虑到缓冲盐溶液对色谱柱和仪器系统产生影响，最终选择0.1%磷酸水溶液作水相，乙腈作为有机相。不同流动相的液相色谱图如图11-13。看时间[min]音图130.1%磷酸水溶液为水相时的色谱图命，因此选择乙腈为有机相。不同有机相的分言看时间[min]图15甲醇为有机相时的色谱图流动相比例的优化：当有机相的比例大于55%时不够(如图16);当乙腈的比例小于45%时，胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸峰形较差(如图17)。流动相比例在50%左右，能得到最稳定的分离效果。三个化合物在6次平行性试验得出的出峰时间的偏差在2.5%以内(如图18)。因此流动相梯度，在分离三个化合物阶段的梯度比例定为1:1.看图16乙腈比例为55%时色谱图图17乙腈比例为45%时色谱图看时间[min]图18乙腈比例为50%时色谱图(3)检测器的确定3mg/kg,定量限10mg/kg。同时根据2014年7月，中华人民共和国农业部公告第2131号；在肉仔鸡配合饲料胆汁酸的添加量范围为60~80mg/kg。最终选取了的检出限为3mg/kg,定量限为10mg/kg;详见图23-25。图19蒸发光散射检测器下10mg/kg胆汁酸色谱图图20蒸发光散射检测器下20mg/kg胆汁酸色谱图者图21PDA检测器3mg/kg胆汁酸的液相色谱图晋图23胆酸标准品PDA光谱图图24猪去氧胆酸标准品PDA光谱图经过上述优化，最终确定的液相参考条件如下：e)流动相：A相为0.1%磷酸溶液，f)检测器条件：检测波长192nm。B相为乙腈，梯度洗脱如表3。表3梯度洗脱程序时间(min)0.1%磷酸水溶液(%)(3)提取溶剂的优化：胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸易溶于醇、乙酸乙酯、乙酸，微溶于水。比较了甲醇、0.1%乙酸甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷作为提取剂的提取效率。试验结果表明三氯甲烷不能提取出胆汁酸；乙酸乙酯虽能提取胆汁酸，但在提取水产用添加剂预混合饲料时回收率小于50%。乙醇和甲醇溶液的提取效果无明显差异，但乙醇沸点高，且与水易形成共沸，不易浓缩。加入适量乙酸，有助于胆汁酸形成酸，被提取溶剂提取出来，试验结果表明0.1%乙酸甲醇比单纯的甲醇，回收率可以提高10%左右。综合考虑，最终选取0.1%乙酸甲醇做为提取溶剂，图26三氯甲烷提取液相色谱图图290.1%乙酸甲醇提取液相色谱图(5)净化条件的优化：为提高上机浓度，尝试了取5g样品，提取溶剂提取后，将提取液全部浓缩但无法避免饲料基质的影响，采用不同的基质，回收率在50~95%之间波动。为实际验证，最后采取了HLB固相萃取柱(6mL/500mg)净化，回收率在80-100%储备溶液(4mg/mL),分别在刚配制完、3个月、6个月时取出。每次试验时，对标准偏差(RSD)均小于10%。试验结果表明，标准储备溶液在-18℃下保存6个月是稳定的，见表4。表4.标准储备溶液稳定性试验结果时间(月)036分别移取适量胆汁酸标准中间溶液，用50%乙腈溶液定容，配制成浓度为表5胆汁酸的线性方程、线性范围、相关系数线性范围/(µg/L）2r图30胆酸标准曲线图32猪去氧胆酸标准曲线取标准中间溶液适量，用流动相稀释，配制成质量浓度分别为50mg/L、猪去氧胆酸标准曲线的相关系数R²为0.99964,鹅去氧胆酸标准曲线的相关系数表6胆汁酸的线性方程、线性范围、相关系数线性范围/(mg/L)图33胆酸标准曲线图35鹅去氧胆酸标准曲线3.3检出限和定量限饲料基质复杂，因此，本试验选择水产用(鱼)、禽用(鸡)2类基质(添加剂预混合饲料、配合饲料、浓缩饲料)共5种饲料作为考察对象。在上述空白饲料中添加一定浓度的胆汁酸对照品，按照本标准进行试验。依据信号与噪声比例，即s/n≥3的浓度为检出限，s/n≥10的浓度为定量限的原则。第一法液相色谱串联质谱法检出限为0.03mg/kg,定量限为0.1mg/kg;第二法液相色谱法检出限为3mg/kg,定量限为10mg/kg。2盛图45液相色谱法-鸡预混合饲料空白基质液相色谱图晋），方法的回收率及精密度均符合GB/T2318方法的回收率及精密度均符合GB/T2318表7鸡预混合饲料基质的加标回收率和相对标准偏差（n=6）123456法酸酸添加浓度(µg/kg）法酸酸表8鸡配置饲料基质的加标回收率和相对标准偏差（n=6）基质123456鸡配置饲料法酸酸添加浓度(µg/kg）法酸酸表9水产预混合饲料基质的加标回收率和相对标准偏差（n=6）基质目123456水产预混合法饲料添加浓度(µg/kg）法表10水产配置饲料基质的加标回收率和相对标准偏差（n=6）123456法酸酸添加浓度(µg/kg）法酸酸表11水产浓缩饲料基质的加标回收率和相对标准偏差（n=6）123456液相色谱法酸酸添加浓度(µg/kg）液相色谱串联质谱法酸酸业科学院农产品质量标准与检测技术研究所等3家单位对标准方法的线性与范经上述方法学验证，该方法可以用胆汁酸(胆含量的测定。同时，胆汁酸在液相色谱串联质谱色谱条件下线性范围为10-500方法的回收率及精密度均符合GB/T2318[1]YangLiu,Md.AbulKalamAzad,ujuanDing1,etal.Dietarybileacidsupplementationinweanedpigletswithintrauterinegrowthretardationimprovescolonicmicrobiota,metabolicactivity,andepithelialfunction[J].JournalofAnimalScienceandBiotechnology,(2023)14:99[2]刘太亮.胆汁酸在河蟹养殖中的应用[J].渔业进展杂志,2017,9：83-84.[3]马志茹,赵盼月,翟少伟.饲料中添加胆汁酸对欧洲鳗鲡幼鱼肝脏脂肪代谢的影响[J].水生生物学报,2023,3(47)：515-522.[4]唐元军，陈育琳，陈庆辉.HPLC-ELSD法同时测定猪胆粉中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量[J].中药新药与临床药理,2010,21（6）：651-653.[5]李志万，马强，袁永生，等.HPLC-ELSD法对猪胆粉中猪去氧胆酸的含量测定研究[J].中国实验方剂学杂志，2005,11（5）：14-16.[6]彭灿，吕蒙莹，李耕，等.牛黄及其代用品胆酸类物质分析方法研究进展[J].中草药,2013,44（5）：632-636.[7]范艳美，贾梦杰，刘培培，等.猪胆粉中猪去氧胆酸的提取、鉴定和含量测定[J].广州化工,2017,45（15）：148-150.[8]周海燕，李丹，黄莹.HPLC法测定胆酸和猪去氧胆酸的含量[J].中国药品标准,2011,12（2）：91-94.[9]杨洪武，王铮，辛敏通，等.薄层扫描法测定人工牛黄及其制剂中胆酸的含量[J].中成药,2003,25（4）：290-293.[10]李隆康.人工牛黄中胆酸和总胆酸含量测定方法探索[J].中国生化药物杂志,1996,17（1）：22-24.[11]谢志宏，周焘，汪晓凌，等.HPL