免疫室SOP文件及孟姜女故事研究

丙型肝炎病毒抗体检测（酶联免疫法）1、原理：本法采用间接法酶联免疫吸附试验原理。在微孔条上预包被基因重组HCV结构和非结构区，配以酶标记IgG抗体及TMB显色等其他试剂，检测人血清或血浆中的丙型肝炎病毒抗体。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血液标本应尽快地送实验室。本试剂使用样品为人血清或血浆，含EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：样品中应无微生物，可在2-8oc储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。3、试剂与仪器：׃3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：北京万泰生物药业股份有限公司3.1.2批准文号：国药准字S200100143.1.3包装：96T×13.1.3试剂配置：浓缩洗涤液50ml×1瓶样品稀释液12ml×1瓶HCV酶标板8×12孔或12×8孔HCV酶标试剂12ml×1瓶HCV阳性对照0.2ml×1支HCV阴性对照0.2ml×1支底物液A、B液各6ml×1瓶终止液6ml×1瓶自封袋1个封版膜2张说明书1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰modelMT-8583.2.2洗板机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。4．2编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔（空白对照孔只加稀释液不加样品及酶标试剂）其余各孔加入100UL样本稀释液。4．3加样：分别在相应孔中加入待测样品，阴，阳对照10微升，轻轻振荡混匀。4．4温育：用封版膜封版后，置37oc温育60分钟。4．5洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。4．6加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶标记抗体100微升，轻轻振荡混匀。4．7温育：置37oc温育30分钟。4．8洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干4．9显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，37oc避光显色30分钟。4．10终止：每孔加终止液1滴（50微升），轻轻振荡混匀。4．11测定：10分钟内测定结果，设定酶标仪单波长450nm或双波长450nm/600-650nm测定。用空白孔调零点后测定各孔A值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为丙型肝炎病毒抗体（抗HCV）阳性；无色者为丙型肝炎病毒抗体（抗HCV）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：CUT/OFF=阴性对照孔A均值+0.12。（不足0.02按0.02计算）5．2．2阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF）者判为抗HCV阳性。(注意初试阳性应重新取样双孔复试)5．2．3阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者判为抗HCV阴性。6：注意事项：6．1本品仅用于体外诊断，操作应按说明书严格进行。封版膜不能重复使用，不同批号酶标板、酶标试剂和阴阳对照不可混用，不能与其他厂家试剂混用。6．2避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液）的环境下操作。6．3使用前请将试剂平衡至室温（平衡30分钟以上）实验前将试剂轻轻振荡混匀，使用后立即放回2-8oc.未用完的微孔板条与干燥剂一起用自封袋密封2-8oc保存。过期试剂请勿使用。6．4加样时必须使用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组分时，用更换加样器吸头和加样槽，以防出现交叉污染。6．5洗涤时各孔均需加满洗液，防止孔内有游离酶不能洗净。使用洗板机应设定30-60秒浸泡时间。再洗板结束后，必须立即进行下一步，不可使酶标板干燥。避免长时间的中断实验步骤，以确保每孔实验条件的均一。6．6结果判定必须以酶标仪读数为准。读取结果时，应擦干酶标板底部，且孔内不能有气泡。不要触碰孔底部的外壁，指印或划痕都可能影响板孔的读值。6．7所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。终止液为硫酸，使用时必须注意安全。6．8显色时必须加显色剂A液后再加显色剂B液，以免显色过低。6．9由于ELISA反应原理的限制，本试剂检测阴性并不排除HCV感染的可能。检测的阳性结果必须结合临床信息进行分析。7：临床意义：检测人血清或血浆中的HCV抗体。适用于血液的筛查及临床丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。梅毒螺旋体抗体（酶联免疫法）1、原理：本试剂盒采用双抗原夹心法酶联免疫吸附试验原理。在微孔条上预包被梅毒螺旋体抗体基因重组抗原，配以酶标记抗原及TMB显色剂等其他试剂，检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血液标本应尽快地送实验室。本试剂使用样品为人血清或血浆，含EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：样品中应无微生物，可在2-8oc储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。3、试剂与仪器：׃3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：北京万泰生物药业股份有限公司3.1.2批准文号：国药准字S200100133.1.3包装：96T×13.1.3试剂配置：浓缩洗涤液50ml×1瓶TP酶标板8×12孔或12×8孔TP酶标试剂12ml×1瓶TP阳性对照0.2ml×1支TP阴性对照0.2ml×1支显色剂A、B液各6ml×1瓶终止液6ml×1瓶自封袋1个封版膜2张说明书1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰modelMT-8583.2.2洗板机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。4．2编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔（用双波长检测，可不设空白对照孔）4．3加样：分别在相应孔中加入待测样品，阴，阳对照100微升，轻轻振荡混匀。4．4温育：用封版膜封版后，置37oc温育60分钟。4．5洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。4．6加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶标记抗体100微升，轻轻振荡混匀。4．7温育：用封版膜封板后，置37oc温育30分钟。4．8洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干4．9显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，37oc避光显色30分钟。4．10终止：每孔加终止液1滴（50微升），轻轻振荡混匀。4．11测定：10分钟内测定结果，设定酶标仪波长于450nm（建议双波长450nm/600-650nm测定）用空白孔调零点后测定各孔A值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为梅毒螺旋体抗体（TP-AB）阳性；无色者为梅毒螺旋体抗体（TP-AB）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：临界值=阴性对照孔A均值+0.18。5．2．2阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF）者判为TP阳性。(注意:初试阳性应重新取样双孔复试)5．2．3阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者判为TP阴性。6：注意事项：6．1本品仅用于体外诊断，操作应按说明书严格进行。封版膜不能重复使用，不同批号酶标板、酶标试剂和阴阳对照不可混用，不能与其他厂家试剂混用。6．2避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液）的环境下操作。6．3使用前请将试剂平衡至室温（平衡30分钟以上）实验前将试剂轻轻振荡混匀，使用后立即放回2-8oc.未用完的微孔板条与干燥剂一起用自封袋密封2-8oc保存。过期试剂请勿使用。6．4加样时必须使用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组分时，用更换加样器吸头和加样槽，以防出现交叉污染。6．5洗涤时各孔均需加满洗液，防止孔内有游离酶不能洗净。使用洗板机应设定30-60秒浸泡时间。再洗板结束后，必须立即进行下一步，不可使酶标板干燥。避免长时间的中断实验步骤，以确保每孔实验条件的均一。6．6结果判定必须以酶标仪读数为准。读取结果时，应擦干酶标板底部，且孔内不能有气泡。不要触碰孔底部的外壁，指印或划痕都可能影响板孔的读值。6．7所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。终止液为硫酸，使用时必须注意安全。6．8显色时必须加显色剂A液后再加显色剂B液，以免显色过低。6．9由于ELISA反应原理的限制，本试剂检测阴性并不排除HCV感染的可能。检测的阳性结果必须结合临床信息进行分析。7：临床意义：检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。适用于血液的筛查及临床梅毒螺旋体抗体感染的辅助诊断。乙肝五项操作规程1、目的：通过对乙型肝炎病毒抗原、抗体系统的检测，用于乙肝的临床诊断，还可应用于对供血员的乙肝筛选、乙肝流行病学的调查，了解各地人群乙型肝炎感染状况。此外，还可用于乙肝疫苗免疫效果的观察。2、方法：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）试验过程大致分三个步骤：=1\*GB3①包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附结合到固相载体表面，使抗原或抗体固相化。=2\*GB3②抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶标记物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定，经洗涤除去游离的酶标记物。=3\*GB3③酶促反应：在反应体系中加入酶的相应底物，使之发生酶促反应而显色。3.临床意义：HBV抗原抗体血清学标志与临床关系较为复杂，必须结合临床特点，对各项检测结果进行综合分析，必要时进行HBV-DNA的检测。常见的HBV抗原、抗体血清学标志物检测结果的分析见下表：HBsAgHBsAbHBcAbHBeAgHBeAb结果分析IgMIgG＋———＋—潜伏期、感染早期或无症状携带者＋—＋—＋—急性乙型肝炎＋—＋＋＋/——急性乙型肝炎后期或慢性感染＋——＋—＋曾感染过HBV—＋————感染过HBV或接种乙型肝炎疫苗后

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）1、原理：采用抗-HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗-HBs-HRP,当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8oc保存。如需长期保存，可在-20℃3、试剂与仪器：3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司3.1.2批准文号：国药准字S109101483.1.3包装：48T×1、96T×13.1.3试剂配置：25倍浓缩稀释液40ml×1瓶HBsAg微孔反应板96孔HBsAg酶结合物6.2ml×1瓶HBsAg阳性对照1.0ml×1瓶HBsAg阴性对照1.0ml×1瓶显色液A、B液各8.0ml×1瓶终止液7ml×1瓶封板纸5片说明书1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释）4．2编号：将样品对应微孔按序编号（共预留阴性对照孔3孔、阳性对照1孔、建议预留空白对照1孔）4．3加样：加入75微升待测样本和阴、阳性对照与反应孔中。4．4温育：用封片纸覆盖反应板后，置37oc温育60分钟。4．5加酶标抗体：取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性、阳性对照孔中加入50微升酶结合物。微孔振荡器或手工轻轻振荡10秒钟。4．6温育：用封片纸覆盖反应板后，置37oc温育30分钟。4．6洗涤：4．6．1手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。4．6．2洗板机：将孔内液体甩干。选择5次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。4．7显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，用封板纸覆盖反应板后，将反应板放置37oc孵育30分钟。4．8终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。4．9测定：用酶标仪读数，波长450nm。（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm或630相近的波长）若需扣除显色剂空白，则先用显色剂空白对照孔校零，然后读取各孔OD值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性；无色者为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：COV:Cut-offValue参考值PC：阳性对照OD值NCx:阴性对照平均OD值。NCx=(NC1+NC2+NC3)÷3检测有效性：NCx≤0.1、PC≥1.0,则检测结果有效。COV=NCx+0.100S:待测样品的OD值，S/COV：待测样本和COV的比值。5．2．2阳性判定：样品OD值S/COV≥1.0者判为HBsAg阳性。5．2．3阴性判定：样品OD值S/COV<1.0者判为HBsAg阴性。6：注意事项：6．1从冷藏环境中取出时应室温平衡至室温后方可使用，未用完的微孔条用加有干燥剂的自封袋密封保存。在平衡试剂的同时，待测样本需平衡至室温后再行测试。6．2使用前试剂应摇匀。6．3显色过程必须封片。所有封片纸不能重复使用。6．4结果判断须在反应终止后10分钟内完成。6．5严格按操作步骤进行，不同批次试剂不可混用。6．6洗板机洗板是应时常检查加液头，确保其畅通无阻塞，洗板是所用的吸水纸请勿反复使用。洗板机的管路用纯化水冲洗，以防阻塞和腐蚀。6．7待测样品不可用NaN3防腐。6．8本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。7：临床意义：检测人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗原，用于血源筛查及临床乙型肝炎病毒感染的辅助判断。乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）1、原理：采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测样品，同时加入HBsAg-HRP，如待测样品中含有抗-HBs时，该抗-HBs就与包被HBsAg、HBsAg-HRP结合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物。加入TMB底物产生显色反应，反之就显色反应。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8oc保存。如需长期保存，可在-20℃3、试剂与仪器：3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司3.1.2批准文号：国药准字2009第34007023.1.3包装：48T×1、96T×13.1.3试剂配置：25倍浓缩稀释液40ml×1瓶HBsAb包被板96孔HBsAb酶标记抗体6.21ml×1瓶HBsAb阳性对照1.0ml×1瓶HBsAb阴性对照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶终止液7.0ml×1瓶封片2片说明书 1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（20*）用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。4．2编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）4．3加样：分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。4．4加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。4．5温育：置37oc温育30分钟。4．6洗涤：4．6．1手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。4．6．2洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。4．7显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，37oc避光显色15分钟。4．8终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。4．9测定：用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎表面抗体（抗－HBs）阳性；无色者为乙型肝炎表面抗体（抗－HBs）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：COV=阴性对照平均OD值×2.1。（阴性对照孔OD值低于0.05者按0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。5．2．2阳性判定：样品的OD值大于或等于COV值时，说明HBsAg阳性。5．2．3阴性判定：样品OD值小于COV值时，说明为HBsAg阴性。6：注意事项：6．1从冷藏环境中取出时试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔反应条应置37℃6．2使用前试剂应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重复使用。6．4结果判断须在反应终止后10分钟内完成。6．5严格按操作步骤进行，不同批次试剂不得混用。6．6待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。6．7本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。乙型肝炎核心抗体（抗-HBc）1、原理：采用基因工程重组HbcAg包被反应板，加入待测样品，同时加入抗-HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样品中抗-HbcAg含量高，则抗-HBc-HRP与HbcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8oc保存。如需长期保存，可在-20℃3、试剂与仪器：3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司3.1.2批准文号：国药准字2008第34007003.1.3包装：48T×1、96T×13.1.3试剂配置：25倍浓缩稀释液40ml×1瓶HBcAb包被板96孔HBcAb酶标记抗体6.21ml×1瓶HBcAb阳性对照1.0ml×1瓶HBcAb阴性对照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶终止液7.0ml×1瓶封片2片说明书 1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（25*）用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。4．2编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）4．3加样：将待测样本用生理盐水1:30稀释。（稀释样本检测结果为临床意义；样本原液加样，检测结果为流行病学意义。用户可根据实际情况选择。）分别在相应孔中加入稀释样本50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。4．4加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。4．5温育：置37oc温育30分钟。4．6洗涤：4．6．1手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。4．6．2洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。4．7显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，37oc避光显色15分钟。4．8终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。4．9测定：用用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎表面抗体（HBcAb）阳性；无色者为乙型肝炎表面抗体（HBcAb）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：未稀释样品CUT/OFF=阴性对照孔OD均值N×0.3。1:30稀释样品CUT/OFF=阴性对照孔OD均值N×0.5。5．2．2阳性判定：样品OD值小于COV，说明该样品HBcAb阳性。5．2．3阴性判定：样品OD值大于或等于COV,说明该样品HBcAb阴性。6：注意事项：6．1从冷藏环境中取出时试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔反应条应置37℃6．2使用前试剂应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重复使用。6．4结果判断须在反应终止后10分钟内完成。6．5严格按操作步骤进行，不同批次试剂不得混用。6．6待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。6．7本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。乙型肝炎e抗原（HBeAg）1、原理：采用抗-HBe包被反应板，加入待测样品，同时加入抗-HBe-HRP，如待测样品中含有HBeAg时就与包被抗-HBe、抗-HBe-HRP结合形成复合物，加入底物产生显色反应，反之就无显色反应。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8oc保存。如需长期保存，可在-20℃3、试剂与仪器：3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司3.1.2批准文号：国药准字2009第34007023.1.3包装：48T×1、96T×13.1.3试剂配置：25倍浓缩稀释液40ml×1瓶HBeAg包被板96孔HBeAg酶标记抗体6.21ml×1瓶HBeAg阳性对照1.0ml×1瓶HBeAg阴性对照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶终止液7.0ml×1瓶封片2片说明书 1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（25*）用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。4．2编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）4．3加样：分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。4．4加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。4．5温育：置37oc温育30分钟。4．6洗涤：4．6．1手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置浸泡30-60秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。4．6．2洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。4．7显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，37oc避光显色15分钟。4．8终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。4．9测定：用用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎e抗原（HBeAg）阳性；无色者为乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：CUT/OFF=阴性对照孔OD均值N×2.1。（阴性对照孔OD值低于0.05者按0.05计算，高于0.05按实际OD值计算）5．2．2阳性判定：样品OD值大于或等于COV值时，说明该样品HBeAg阳性。5．2．3阴性判定：样品OD值小于COV值时，说明该样品HBeAg阴性。6：注意事项：6．1从冷藏环境中取出时试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔反应条应置37℃6．2使用前试剂应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重复使用。6．4结果判断须在反应终止后10分钟内完成。6．5严格按操作步骤进行，不同批次试剂不得混用。6．6待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。6．7本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。乙型肝炎e抗体（抗-HBe）1、原理原理：采用抗-HBe、HBeAg包被反应板，加入待测样品，同时加入抗-HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样品中抗-HBe含量高，则抗-HBe-HRP与HBeAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。2、标本采集与处理׃2.1受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8oc保存。如需长期保存，可在-20℃3、试剂与仪器：3.1测定试剂：3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司3.1.2批准文号：国药准字2009第34007043.1.3包装：48T×1、96T×13.1.3试剂配置：25倍浓缩稀释液40ml×1瓶HBeAb包被板96孔HBeAb酶标记抗体6.21ml×1瓶HBeAb阳性对照1.0ml×1瓶HBeAb阴性对照1.0ml×1瓶底物液A、B液8.0ml×1瓶终止液7.0ml×1瓶封片2片说明书 1份3．2测定仪器：3.2.1酶标仪：上海安泰MODELMT-8583.2.2洗扳机：ANALYTECH8284、操作步骤：4．1配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（25*）用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。4．2编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）4．3加样：分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。4．4加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。4．5温育：置37oc温育30分钟。4．6洗涤：4．6．1手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。4．6．2洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。4．7显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，37oc避光显色15分钟。4．8终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。4．9测定：用用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。5：结果判断5．1目测：在白色背景下观察各孔显色情况，无色者为乙型肝炎e抗体（HBeAb）阳性；黄色者为乙型肝炎e抗体（HBeAb）阴性。5．2酶标仪检测：5．2．1临界值（CUT/OFF）计算：COV=(阴性对照平均OD值+阳性对照平均OD值)×0.55．2．2阳性判定：样品OD值S/CO≤1者判为HBeAb阳性。 5．2．3阴性判定：样品OD值S/CO＞1者判为HBeAb阴性。6：注意事项：6．1从冷藏环境中取出时试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔反应条应置37℃6．2使用前试剂应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加。6．3封片不能重复使用。6．4结果判断须在反应终止后10分钟内完成。6．5严格按操作步骤进行，不同批次试剂不得混用。6．6待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。6．7本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。丙肝抗体检测（HCV-Ab）1.方法：胶体金法2.原理：本品采用胶体金免疫层析专业技术，在玻璃纤维素膜上预包被金标鼠抗人IgG抗体，在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被丙肝混合抗原和人IgG抗体。检测阳性标本时，血清样本中HCV-Ab与胶体金标记鼠抗体IgG抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗原结合形成“Au-anti-IgGAb-HCVAb-HCVAg”夹心物而凝聚显色，游离金标鼠抗人IgG抗体则在对照线处与人IgG抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色，15分钟内观察结果即可。3.试剂英科新创（厦门）科技有限公司4.试剂组成4.1HCV胶体金试纸条50条4.2说明书1份4.3样品稀释液4.4塑料滴管5.仪器目测6.操作步骤6.1将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。6.2用塑料滴管加1滴样本血清或血浆，加到试纸条指示箭头下端的加样处。6.3随即加2滴样本稀释液。6.4加样后，阳性标本可在1-15分钟内检出，建议15分钟再最终观察并记录试验结果。7.结果判断阴性：出现一条红线。阳性：出现二条红线。无效：不出现红线。8.正常参考值阴性9.临床意义同ELISA法测定。10.标本采集10.1无菌条件下抽取静脉血2毫升，及时分离血清。10.2如采用血浆测定，临床常用抗凝剂（EDTA、肝素、枸橼酸钠）不影响实验结果。10.3标本溶血、脂血、严重黄疸或加热灭活的血清标本均可能影响检测结果。11.注意事项11.1标本应新鲜澄清。11.2在良好光线下判断结果。11.3试剂从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中时间过长，导致受潮。11.4检测线颜色的深浅程度与样品中抗体的滴度没有一定的必然；联系。11.5任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度抗体存在，所以阴性结果任何时候不能排除含有HCV暴露和感染的可能。11.6实验证实，乙肝、艾滋、甲肝、庚肝、类风湿因子、红斑狼疮等各种类型的标本不会对测试产生干扰。梅毒抗体检测（TP-Ab）1.方法：胶体金法2.原理：本品采用胶体金免疫检测技术和层析原理，定性检测血清（浆）样本中的梅毒螺旋体抗体。检测时，样本中梅毒抗体可与胶体金标记抗原结合形成抗原抗体复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗原结合形成“Au-TPAg-TPAb-TPAg”夹心物而凝聚显色，游离胶体金标记梅毒抗原则在对照线处与与预包被的兔抗TP抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。3.试剂英科新创（厦门）科技有限公司4.试剂组成4.1TP胶体金试纸条50条4.2说明书1份5.仪器目测6.操作步骤6.1将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。6.2将试剂置于干净平坦的台面上，在加样条上用微量加样器加入100ul样本。6.3加样后，20分钟观察并记录试验结果。7.结果判断阴性：出现一条红线。阳性：出现二条红线。无效：不出现红线。8.正常参考值阴性9.临床意义同ELISA法测定。10.标本采集10.1静脉的血清、血浆样本必须在无菌条件下，并避免样品溶血。10.2血清和血浆样品（EDTA抗凝）收集后7天内检测，样品须放在2-8℃保存11.注意事项11.1本试剂盒仅用于体外诊断试验，仅用于人血清（浆），其它体液和样本可能得不到准确结果。11.2样本的加样建议使用微量加样器准确加入。11.3试剂从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中时间过长，导致受潮。11.4检测线颜色的深浅程度与样品中抗体的滴度没有一定的必然；联系。22分钟后判读，结果无效。11.5任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度抗体存在，所以阴性结果任何时候不能排除含有梅毒螺旋体暴露和感染的可能。本品检测阳性样本，需用其它方法作进一步的确认。乙肝病毒表面抗原（HBsAg）1方法胶体金法2原理本品采用胶体金免疫层析专业技术，在玻璃纤维素膜上预包被HBsAg,在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被HBsAg单抗（sAb2）和羊抗鼠IgG.检测阳性血清或血浆样本时，样本中HBsAg与胶体金标记抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗体结合形成夹心物而凝聚显色，游离金标抗体则在对照线处与羊抗鼠IgG结合而富集显色。阴性标本则尽在对照线处显色。3试剂英科新创（厦门）科技有限公司4试剂组成4.1试纸条25条4.2说明书1份5仪器目测6操作步骤6.1将试纸条取出，水平放置并做好标记。6.2用加样器或毛细吸管吸取60ul新鲜全血（或血清、血浆）缓慢滴加与试剂条箭头下方的垫片上6.3为防止弱阳性标本的漏检，请于加样后10分钟观察并记录试验结果。7结果判断阴性：出现一条红线。阳性：出现二条红线。无效：不出现红线。8正常参考值阴性9临床意义同ELISA法测定。10标本采集10.1可采用全血、血清、血浆进行检测，血浆标本对抗凝剂无要求。10.2采集静脉血的血清血浆应在无菌条件下，避免样品溶血。10.3血清、血浆在7天内检测，样品须放在2-8℃11注意事项11.1实验室环境应保持一定湿度、避风。避免在过高温度下进行。11.2试纸可在室温下保存，谨防受潮。低温保存下的应平衡室温方可使用。11.3试剂从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中时间过长，导致受潮。11.4实验应在加样10分钟内判读结果，只需在检测线出现紫红线，即可判断阳性结果。 室内质量控制程序1.目的：保证ELISA检测结果准确可靠,充分发挥其方法学的优点。2.该SOP变动程序：本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。3.方法3.1分析前质控3.1.1人员培训⑴实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：⑵检验项目的基本原理（ELISA原理）；⑶临床意义；⑷熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；⑸熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；⑹熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。⑺某些特殊项目检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。室内质控血清的制备：⑴质控血清每年列出计划报质控组采购，一般采用CutOff值附近的阳性⑵质控血清-20℃冻存备用；⑶使用前室温复融。试剂盒选择卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产品。试剂盒评价：⑴根据该试剂生物制品鉴定所的批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；⑵通过询问试剂包被物的组成，如原料来源（基因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），片段的长短等判断试剂的优劣；⑶参考室间质评报告中对试剂的评价结果，了解不同试剂的质控成绩。⑷临床实验室根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。仪器质控为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。⑴移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内；⑵水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；⑶洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；⑷酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。⑸酶标仪校正程序：a)滤光片波长精度检查：将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201型紫外-可见分光光度计（波长精度±0.3nm）于可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。一般酶标仪无585nm滤光片，可选用550nm或630nm滤光片。450nm滤光片的检定选用普鲁兰溶液（校正波长为630nm）。b)通道差与孔间差检测：通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体，将其（内含200ul甲基橙溶液吸光度调至0.500A左右）置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，于490nm处连续测三次,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条（8条共96孔）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水调零,于490nm处检测，其误差大小用±1.96s衡量。c)零点飘移（稳定性观察）：取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均加入200ul蒸馏水并调零，于490nm处每隔30分钟测一次，观察各个通道4小时内吸光度的变化。d)精密度评价：每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同浓度的甲基橙溶解，蒸馏水调零，于490nm作双份平行测定，每日测二次（上下午各一次），连续测定20天。分别计算其批内精密度，日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV值。e)线性测定：用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液，于490nm平行测8次，取其均值。计算其回归方程，相关系数及标准估计误差s，并用±1.96s表示样品测量的误差范围.双波长测定评价：取一分甲基橙溶液，分别加入3种不同浓度的溶血液（测定波长为490nm，校正波长为585nm），先后于8个通道检测，每个通道测3次，比较各组之间是否具有统计学差异，以考察双波长消除干扰组分的效果。3.1.5标本的采集和保存⑴标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本会增加非特异性显色造成假阳性。临床实验室⑵长菌的标本同样的道理也易产生假阳性，因菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应。临床实验室⑶抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝剂。⑷标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。反复冻融会使抗体效价跌落，如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。⑸ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本。3.2分析中质控临床实验室ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。⑴加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。⑵每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染；干吸头预先在血清中抽吸三次。⑶样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。⑷如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。3.2.2温育⑴抗原抗体反应需要在一定温度下（37°C），经过一定的时间才能达到反应的平衡点，ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。水要浸至板条的1/3处。⑵反应板不宜叠放，注意温育的温度和时间应按规定控制，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。3.2.3洗涤⑴手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液；2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。⑵洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。临床实验室3.2.4显色⑴HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37°C，10-15分钟）恒定反应后终止；⑵或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间。3.2.5酶标仪判读结果a)显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。b)常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，二种底物的校正波长均用630nm。c)使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。3.3分析后质控3.3.1报告方式定性试验：国内外为便于统一计算，一律按S/COV方式报告，S为标本A值，COV即CutOff值（或COV）⑴夹心法和间接法以S/COV≥1为阳性；竞争法与中和法以S/COV﹤1为阳性⑵COV的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：a)COV=2.1×N（当N不足0.05时按0.05计），此公式由P/N>2.1换算而来，常用于夹心法。b)COV=0.5×N，从抑止率公式换算而来，常用于竞争，中和法。c)COV=N+C（C为常数），用于间接法。d)COV=C×P+N（C为常数），用于间接法。此公式最客观，但对厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。定量分析：严禁用定性试剂盒做定量分析。⑴用已知量的系列标准品，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。⑵现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的结果实属不易。⑴所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。⑵如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致。a)定性试验ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC要保证试验的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值S/C.O≥1，高值质控血清S/C.O≥10，正常人血清A值在0.05-0.07之间。阳性质控血清失控（临界值为灵敏度，高值为“HOOK”效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做阳性标本。以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为QC资料存档。b)定量试验ELISA定量试验常见于肿瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素类，免疫球蛋白类，这些物质在体内有一定的量（正常范围），超出这个量才呈病理情况，故需定量测定。定量试验的质控方法可参考生化方式。c)“即刻性”质控在开始进行质控时，只需要有3个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X，s。方法：⑴先将测定值从小到大排列，X1最小，Xn最大；⑵计算X和s；⑶计算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S⑷对照SI表，检查是否出控，SI上、下限≤规定值，在控；SI上或下限>规定值，失控。室间质量控制程序目的采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。。【基本概念】【质量控制】是监视ELISA操作全过程，排除误差，维持标准化操作的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的：1.确定控制的对象；2.规定控制对象的标准（预期值）；3.制定或选择控制方法和手段；4.测量实际数据；5.比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。6.采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的可追查性原因。可追逆性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。在GLP概念里QC即指IQC，其定义为：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本室工作的可靠性，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高批内批间样本检验的一致性，以确定检验报告是否可靠或可否发出的一项工作。免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此QC手段不能照搬生化模式。【灰区概念】把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将COV值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。灰区的设置有二种：1.COV×（1±CV），CV为该试剂的批内CV(一般在15-20%间)；2.COV±2s，s为实验室做室内质控ROC的s。【高值钩镰效应（HD-HOOK）】在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGHDOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974）根据此现象写实性地称之为"HD-HOOK"效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。一步法和二步法均存在"HD-HOOK"效应，只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。【质量控制血清】质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。质控血清的制备，每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。1.收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。2.56℃3.离心或过滤除去沉淀。4.用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。5.抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃6.标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对比测定。【室间质评的方法】1.发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将结果报至组织者（部、省临检中心）。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打电话修改结果而达不到真正评价作用。这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。2.现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。这种方法可以解决实际问题，进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。派观察员到实验室进行试剂调查，这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。【成绩计算方法】1.定性试验：检验结果与预期结果一致，得100分，错误不得分，总计实验室的得分。从全部参评单位的得分中求出该批质控物平均分（X）和标准差（s），再通过公式计算出每一个实验室的得分比值（SI）SI=（实验室得分-平均分X）/平均标准差（s），SI在0.0-0.9间为良好,1.0-1.9间为优秀,SI为负值时数值越大成绩越差。2.定量试验：SI=（实验室测定值-预期值X）/预期值的标准差s，SI越小，表明越靠近靶值，成绩越好。0-1.0为优秀,1.1-2.0为良好,>2.0为差。SI无正负之分。质量改进（QualityImprovement，QI）】质量改进的建议来源于三方面：1.室内质控：提示实验的精密度差，应规范各项操作；2.室间质评：提示实验的准确性差，应改进设备的准备或更换试剂；3.病人或医生的报怨：提示实验的偶然误差，应分析实验的质控过程是否达标。一、孟姜女故事历史的系统

(1)此故事最早见的，是《左传》。襄公二十三年(公元前549)传说，齐将记梁在莒国战死；齐侯回来，在郊中遇见记梁之妻，使吊之。她以为郊中不是吊丧的地方，把他却去。因此齐侯到她的家里吊了。在这一段记载里，只见得她是一个知礼的妇人。还有和记梁同战的华还结果如何，书上没有记载。

(2)次见的是《檀弓》。它引曾子的话道：“杞梁死，其妻迎其柩于路而哭之哀。”这是说明她遇见齐侯为的是迎柩；“哭之哀”三字又涂上了感情的色彩了。

(3)其次是《孟子》上的淳于凭的话。他道：“王豹处于淇而河西善沤，绵驹处于高唐而齐右善歌，华周杞梁之妻善哭其夫而变国俗。”他把记梁妻的哭和王豹、绵驹的歌讴同举，并说因她的哭夫而变了国俗，可见齐国唱她的哭调的风气是很盛行的。据战国时的记载，雍门周以哭见孟尝君，孟尝君为之流涕狼戾；韩娥过雍门，曼声哀哭，一里老幼悲愁，其后雍门人善放娥之遗声：可见齐都中人的好唱哭调原是战国时的风气。所以我们可以怀疑淳于髠这话是倒果为因的：因为齐国有此风气，所以成了记梁之妻的哭；她的哭中原有韩娥们的成分，她的故事中加入的哀哭一段事原是战国时音乐界风气的反映。

(4)在西汉时，她的故事依然向着这方面发展。枚乘《杂诗》说：“上有弦歌声，音响一何悲?谁能为此曲，无乃记梁妻?”王褒《洞策赋》形容策声的妙，说：“镭期、牙、怅张然而愕立兮，杞梁之妻不能为其气。”

(5)到西汉的后期，这个故事的中心忽从悲歌而变为崩城。刘向在《说苑》及《列女传》中都说她在夫死后向城而哭，城为之崩；《列女传》中并说她因无人可靠，赴淄水而死。这样的任性运行，和却郊吊的知礼的态度大不相同，刘向采入书中，可见“齐东野人”的传说的力量胜过了经典中的记载了。

(6)她哭崩的城的所在，东汉初年王充《论据》里首说是记城，并说给她哭崩了五丈(《变动篇》》。杞国当把梁死时建都在缘陵(今山东昌乐县)，离临淄很近，从莒到齐可以经过，这说如当实事看也说得通。顺从这一说的，有东汉末邯郸淳说的“杞崩城隅”(《曹娥碑》)，西晋时崔豹说的“杞都城感之而颓”(《古今注》》。

(7)三国时，她的故事忽然出了一个非常可怪之论。曹植在《黄初六年令》中说“杞妻哭梁，山为之崩”，又于《精微篇》中说“杞妻哭死夫，梁山为之倾”，可见那时有她哭崩梁山的传说。这种传说在王充时还没有，所以他驳崩城之说时尚说“哭能崩城，复能坏山乎！”他从大处极力的一驳，哪知不久就从他驳桔的理内中生出了新的传说来了。梁山崩是春秋时的—件大事(成公五年，公元前五八六)，当然在山陕间可以构成一种传说。这种传说和杞妻的传说结合，主要的理由固然为了她的哀哭的感天，但一半也因了记梁的字“梁”，与杞梁的氏“杞”而崩杞城一样。这种传说似乎并不普遍(曹植文中既说“崩山陨霜”，又说“崩城陨霜”)，后来便歇绝了。李白诗中虽有。梁山感杞妻，锄哭为之倾”(《东海有勇妇》)的话，说不定他是沿袭曹植所用的典故。(清《韩城县志》云，“孟姜女祠在大崩邨，今废”，或是这件故事的尾声。)

(8)东汉末，蔡吕著的《琴操》有《记梁妻叹》一曲，这是第一次把她的歌辞写出的；歌道：“乐莫乐号新相知！悲莫悲今生别离!哀感皇天城为堕！”上二句是《楚辞·少司命》中语，下一句是她自己说堕城，都很奇突。此后叙述她的歌曲的，有西晋崔豹《古今注》和五代马缟《中华古今注》。崔豹说此歌是她的妹明月所作，马缟说是她的妹朝日所作。

(9)后魏郦道元在《水经注》中说她哭崩的城是莒城(《沐水》条)。这或因《列女传》中有“枕其夫之尸于城下而哭”的话，杞梁既死于莒，其妻也应该到莒去哭，所以由他自己改定的。这句话因为没有传说在背后衬托，所以没有势力；只有明杨仪及清王照圆一班读书人才在《明良记＝和《列女传》注中引了。

(10)《同贤记》(不知何人撰，见《{王周}玉集》引；日本写本《{王周}玉集》题天平十九年，即唐玄宗天宝六年[七四七]，可见此书是中唐以前人所作，《同贤记》又在其前》说燕人记良避始皇筑长城之役，逃入孟超后园；孟超女仲姿浴于池中，仰见之，请为其妻。杞良辞之。她说：“女人之体不得再见丈夫”，就告知父亲嫁他。夫妻礼毕，良回作所，主典怒其逃走，打杀之，筑城内。仲姿既知，往向城哭。死人白骨交横，不能辨别，乃刺指血滴白骨，云，“若是记良骨者，血可流入”。沥至良骸，血迳流入！便收归葬之。这个记载比较了以前的传说顿然换了一副新面目。第一，它把杞梁改名为良，并且变成了秦朝的燕人而筑长城了。第二，它把杞梁之妻的姓名说出了，是姓孟名仲姿。第三，杞良是避役被捉打杀，筑在长城内的，所以她要向城而哭。第四，筑入长城内的死尸太多，所以她要滴血认骨。

这几点都很可注意。孟仲姿的姓名或是从孟姜讹变的，也许孟姜是从孟仲姿讹变的，现在没有证据，未能断定。说杞良为燕人，想因燕近长城之故，或者这一种传说是从燕地起来的。滴血认骨是六朝时盛行的一种信仰，萧综私发齐东昏墓一件事是一个证据。至于记梁筑长城，孟仲姿哭长城，这里面自有复杂的原因。其一，是由于事实上的。隋、唐间开边的武功极盛，长城是边疆上的屏障，戍役思家，闺人怀远，长城便是悲哀所集的中心。记梁妻是以哭夫崩城著名的，但哭崩记城和莒城与当时民众的情感不生什么联系，在他们的情感里非要求她哭崩长城不可。其二，是由于乐曲上的。乐曲里说到城的，大抵是描写筑城士卒的痛苦。如陈琳《饮马长城窟行》说“君独不见长城下，死人骸骨相撑拄”，王翰的诗说“长城道傍多白骨，……云是秦王筑城卒，……鬼哭啾啾声沸天”，张籍《筑城曲》说“千人万人齐抱杵，……军吏执鞭催作迟，……杵声未定人皆死；家家养男当门户，今日作君城下士”，都是。在这些歌词中，都有招他们的闺人去痛哭崩城的倾向。杞梁妻既以哭城和崩城著名，自然会得请她作这些歌词中的主人，把她的故事变为哭长城而收