灌木辣椒种质鉴定技术规程SSR分子标记法

3DB36/XXXXX—XXXX灌木辣椒种质鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）种质技术有关的术语和定义、仪器设备与主要试剂耗材、溶液配制、核心引物、参照种质、操作步骤、指纹比对和结果判定。本标准适用于灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）种质的SSR分子指纹比对鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T3543.2农作物种子检验规程。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1待测种质待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。3.2参照种质用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质。3.3核心引物多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3.4指纹图谱采用SSR核心引物（或相当于核心引物）扩增出的待测种质和参照种质的DNA片段，通过变性聚丙烯酰胺电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。4DB36/XXXXX—XXXX3.5指纹比对将待测种质与参照种质的SSR指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的SSR指纹是否有差异，并确定其大小。4原理SSR分子标记，广泛分布于辣椒基因组中。不同种质间每个SSR位点重复单位的数量可能不同，因而形成SSR标记多态性。由于每个SSR位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。通过电泳分离得到大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定灌木辣椒品种。5仪器设备与主要试剂耗材仪器设备及试剂、耗材参见附录A。6溶液配制溶液配制方法参见附录B。7核心引物核心引物相关信息见附录C。8参照种质参照种质参见附录D。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。9操作步骤9.1样品准备种子样品的扦样和保存，按照GB/T3543.2的规定执行。取待测种质和参照种质的新鲜、幼嫩、健康叶片1片，每个种质取10个个体，混合制样并做好标5DB36/XXXXX—XXXX记，用纱布包好并置于液氮罐中。9.2DNA提取9.2.1待测种质和参照种质采用改良CTAB法提取DNA，步骤如下：a）将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速用2ml离心管将粉末勺进管的2/5处，迅速加入预热至65℃的CTAB提取液1ml（加入前先加入1%的β-巯基乙醇充分混匀后将2ml离心管放入65℃水浴锅中，水浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应。b）取出离心管静置至数分钟后放入4℃高速低温离心机中，13000rpm离心15min。取上清液至另一离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）后，充分混匀，静置10min。13000rpm离心10min。c）取上清液800μl置于新的1.5ml离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃冰箱30min或者过夜。d）取出步骤c的离心管在4℃下条件下，13000rpm离心10min，弃上清。用75%乙醇洗涤DNA两次，放在桌面自然晾干。e）向1.5ml离心管中加入200μlddH2O将DNA溶解，再加5μl10mg/mlRNaseA37℃水浴60min。加入等体积200μl预冷的氯仿：异戊醇（24:1）混匀，静置10min，12000rpm离心10min。f）取上清加入1/10(总)体积的NaAc（3mol/L2倍体积冷的无水乙醇。-20℃放置30min或更长时间，在4℃下13000rpm，离心15min。用冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，放至桌面自然晾干。g）加200μl灭菌1×TE溶解DNA，并用核酸测定仪检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/μl最后将离心管放入-20℃冰箱保存备用。9.2.2若采用试剂盒法提取DNA，需按照试剂盒的说明进行提取，并按照9.2.1步骤g）的方法存放。9.3PCR扩增9.3.1PCR反应体系0.4μl上游引物（10mM0.4μl下游引物（10mM0.1μlTaq酶（5U/μl2μlDNA模板（20ng/μl5.1μlddH2O。9.3.2PCR反应程序所述PCR反应程序：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性45s；(3)按附录C推荐的引物退火温度退6DB36/XXXXX—XXXX火45s；(3)72℃延伸45s；(5)重复步骤(2)-(4)，共35个循环；(6)72℃延伸10min；(7)4℃保存。9.4PCR扩增产物检测9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳9.4.1.1玻璃板处理用自来水分别清洗长、短两块玻璃板洗净，晾干后用95%的酒精淋洗玻璃板表面，晾干。用擦镜纸（或质量好的卫生纸）将500μl亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将500μl剥离硅烷也均匀涂在带有凹槽的短玻璃板上。等其完全反应后（约4-5min后用无水乙醇反复擦拭玻璃板2-3次，除去玻璃板上多余的亲和硅烷和剥离硅烷。操作过程中防治两块玻璃板互相污染。9.4.1.2组装玻璃板将长板平放，用厚度为0.4mm干净的垫片放于玻璃板的左右两侧，将带有凹槽的短板板压于其上，并使两块玻璃底部和垫片对齐，然后用夹子夹紧两侧，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。用样品梳反向插入，以梳子正好插入为适，不宜太紧也不宜太松，即可认为组装完好。9.4.1.3制胶取75ml6%工作胶溶液至烧杯中，加500μl10%过硫酸胺(APS)与50μlTEMED后，摇匀后迅速将胶液灌入玻璃胶室，注意防止灌入气泡。待胶室灌满后，在凹槽处鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳至适当位置，在室温下聚合1h以上。凝胶聚合后，轻轻拔出样品梳，用水冲洗清洗掉凹槽处残留的凝胶，清洗干净备用。9.4.1.4预电泳将胶板垂直固定于电泳槽上，上槽加入约1200ml的1×TBE电泳缓冲液，约高出凹槽板2cm左右，下槽加入500ml的1×TBE电泳缓冲液。再次用胶头滴管将凹槽处剩余凝胶碎片冲出。恒功率100W，设定电压2000V条件下预电泳20min。9.4.1.5样品制备在10μlPCR产物加入4μl上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上94℃变性4min后，取出，立即放入碎冰中冷却10min。9.4.1.6点样及电泳在预电泳结束后，用胶头滴管把加样孔内的气泡冲出，把梳子正向插入凝胶，齿尖入胶深度以不超过lmm为宜，每个加样孔加入5μl扩增产物，在胶板两侧点入DNAMarker。除待测样品外，还应同时加入参照种质的扩增产物。设恒功率60W，电压2000V条件下电泳，在溴酚蓝指示剂接近胶板底部7DB36/XXXXX—XXXX时，结束电泳。在电泳过程中确保胶板温度不高于55℃,以免玻璃板破裂。9.4.2银染检测采用简单快速的DNA银染法：a)将长、短玻璃板分开：电泳结束后，小心地将长、短玻璃板分开，聚丙烯酰胺凝胶应粘在长玻璃板上。b)洗胶：在托盘A中用超纯水漂洗凝胶2次，每次15s，在将玻璃板取出时，让玻板竖直滴干10~20s，再进行下一次洗涤。c)染色：在托盘B中加入1.2L染色液，将有胶的玻板放入托盘，在摇床轻摇10min。d)洗胶：将胶浸入装有超纯水中的托盘A清洗胶面约5s；取出沥水后，立即放入盛有预冷显影液e)显色：把托盘C放在摇床轻摇5-7min至条带清晰的呈现出来，不宜显色太久，否走背景太深，影响读带。f)洗胶：用自来水冲洗玻璃板2min，将胶上多余的NaOH溶液冲去，避免其造成玻璃模糊而影响读带。g)干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干。10指纹比对样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。根据待测种质与参照种质的SSR条带位置，确定是否有差异，并根据DNAMarker和待测样品条带的位置比较分析，确定待测种质和参照种质的片段大小。11结果判定用附录C中引物进行检测，若待测种质能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则判定待测种质为灌木辣椒（C.frutescens）种质；若待测种质不能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则判定待测种质不是灌木辣椒（C.frutescens）种质”。8DB36/XXXXX—XXXX（资料性附录）主要仪器设备与试剂、耗材A.1主要仪器设备A.1.1PCR扩增仪器。A.1.2高压电泳仪。A.1.3垂直电泳槽及配套的制胶附件。A.1.4高速冷冻离心机。A.1.5水平摇床。A.1.6制冰机。A.1.7电子天平。A.1.8微量移液器。A.1.9核酸测定仪。A.1.10高压灭菌锅。A.1.11纯水仪。A.1.12恒温水浴锅。A.1.13磁力搅拌器。A.1.14PH计。A.1.15胶片观察灯。A.1.16微波炉。A.1.17冰箱。A.2主要试剂在分析中均使用分析纯试剂。A.2.1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）。A.2.3乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。A.2.4氯化钠。A.2.5三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）。A.2.6浓HCL。9DB36/XXXXX—XXXXA.2.7Tris饱和酚。A.2.8RNaseA。A.2.9β-巯基乙醇。A.2.10氯仿。A.2.11异戊醇。A.2.12无水醋酸钠。A.2.13无水乙醇。A.2.14丙烯酰胺。A.2.15甲叉双丙烯酰胺。A.2.16硼酸。A.2.17尿素。A.2.18亲和硅烷。A.2.19剥离硅烷。A.2.20过硫酸铵(APS)。A.2.21四甲基乙二胺（TEMED）。A.2.22甲醛。A.2.23硝酸银。A.2.24氢氧化钠。A.2.25无水碳酸钠。A.2.2698%去离子甲酰胺。A.2.27溴酚蓝。A.2.28二甲苯青FF。A.2.29DNAMarker（100bpladder）。A.2.30矿物油。A.2.31TaqDNA聚合酶。A.2.32SSR引物。A.2.33dNTPs。A.2.3410×Buffer缓冲液。DB36/XXXXX—XXXXA.2.35Mg2+。A.2.36液氮。A.2.37ddH2O，超纯水。A.3主要耗材A.3.1离心管（1.5ml，2ml）。A.3.2移液器配套枪头。A.3.3配套枪头盒。A.3.496孔PCR板。A.3.5长、短玻璃板。A.3.6烧杯。A.3.7研钵、研棒。A.3.8乳胶手套。A.3.9一次性手套离心管（1.5ml，2ml）。A.3.10量筒。A.3.11胶头滴管。A.3.12玻璃棒。A.3.13滤纸。A.3.14漏斗。A.3.15托盘。DB36/XXXXX—XXXX（规范性附录）溶液配制B.1DNA提取溶液的配制B.1.11mol/LTris-HCL溶液（PH=8.0）称取24.22gTris碱置于250ml烧杯中，加入约160mlddH2O，充分搅拌，加入约8.4mlHCL调PH值至8.0，加ddH2O定容至200ml，121℃高温高压灭菌20min。B.1.20.5mol/LEDTA溶液（PH=8.0）称取37.22gNa2EDTA·2H2O置于250ml烧杯中，加入约160mlddH2O，充分搅拌，用固体NaOH调PH值至8.0，加ddH2O定容至200ml，121℃高温高压灭菌20min。B.1.32%CTAB溶液称取CTAB20g，NaCL81.9g，PVPP10g置于1000ml烧杯中，加入约500mlddH2O搅拌，再加入1mol/LTris-HCL（PH=8.0）溶液100ml，0.5mol/LEDTA（PH=8.0）溶液40ml，65℃水浴溶解，加ddH2O定容至1000ml，121℃高温高压灭菌20min。B.1.4酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液量取100mlTris饱和酚的下层有机相，96ml氯仿，4ml异戊醇置于棕色瓶中，充分混匀。B.1.5氯仿/异戊醇（24:1）溶液量取240ml氯仿，10ml异戊醇置于玻璃瓶中，充分混匀。B.1.63mol/LNaAc溶液（PH=5.2）称取12.34g无水NaAc置于100ml烧杯中，加入约20mlddH2O，搅拌溶解，用冰醋酸调PH值至5.2，加ddH2O定容至200ml，121℃高温高压灭菌20min。B.1.71×TEbuffer溶液用移液器吸取1mol/LTris-HCL（PH=8.0）溶液1ml，0.5mol/LEDTA（PH=8.0）溶液200μl，加ddH2O定容至100ml，121℃高温高压灭菌20min。B.1.875%酒精溶液量取150ml无水乙醇，50mlddH2O置于烧杯中，充分混匀。B.2PCR扩增溶液的配制B.2.1SSR引物稀释合成的引物（见附录C）先在高速离心机中5000r/min离心30s，根据引物的说明书稀释到工作液DB36/XXXXX—XXXX浓度10μmol/L。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制B.3.110×TBE缓冲液分别称取Tris碱108g，硼酸55g置于1000ml烧杯中，量取加超纯水定容至1000ml。B.3.240%丙烯酰胺凝胶溶液分别称取丙烯酰胺380g和甲叉双丙烯酰胺20g置于1000ml烧杯中，加入600mlddH2O慢慢搅拌，37℃水浴溶解，定容至1000ml，过滤，4℃保存。B.3.36%变性聚丙烯酰胺溶液称取420g尿素置于1000ml烧杯中，再分别加入100ml10×TBE缓冲液和40%丙烯酰胺凝胶溶液150ml，加入600mlddH2O慢慢搅拌，37℃水浴溶解，加超纯水定容至1000ml。B.3.410%APS溶液称取5g过硫酸铵，加入50mlddH2O溶解，4℃保存一周即更换。B.3.51×TBE缓冲液量取10×TBE缓冲液100ml，用超纯水定容至1000ml。B.3.6上样缓冲液分别称取溴酚蓝25mg，二甲苯青25mg置于玻璃瓶中，加入98%去离子甲酰胺98ml和0.5mol/LEDTA（PH=8.0）溶液2ml，混匀。B.4银染溶液的配制B.4.1染色液称取硝酸银1.2g，加超纯水定容至1200ml。B.4.2显色液称取NaOH24g，无水碳酸钠0.48g，加超纯