双缩脲测定奶粉中蛋白质的含量

PAGEPAGE2双缩脲法测定奶粉中的蛋白质含量【摘要】

目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用双缩脲法测定蛋白质的含量，在540nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。【关键词】

奶粉；蛋白质；双缩脲法；标准曲线1【前言】蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，奶粉中蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多,如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用双缩脲法快速测定奶粉中的蛋白质含量。2实验目的（1）学习从奶粉中提取酪蛋白的原理和方法；（2）掌握利用双缩脲法对蛋白质含量的测定的原理和方法；（3）掌握利用分光光度法对物质的定性和定量测定的原理和方法；3实验原理3.1奶粉中提取蛋白质的原理奶粉中主要蛋白质是酪蛋白，每100克婴幼儿奶粉中含12克～25克。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将奶粉用蒸馏水溶解，然后将其PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯酪蛋白。3.2双缩脲测定蛋白质的原理当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围1-10mg4实验设备可见光分光光度计1台、离心机1台、电热器1台、电子天平（0.01g）1台、pHS-3C酸度计1台、烧杯、试管15支、漏斗、移液管若干、胶头滴管2~3支、离心管5实验材料和试剂5.1材料与试剂奶粉，双缩脲试剂，体积分数95%乙醇120ml，无水乙醚120ml，0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液牛血清白蛋白标准溶液蒸馏水5.2缓冲液的配制缓冲溶液300ml（先配置A液和B液）A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAc·3H2O5.44B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）2.4g，定容至200ml取A液177Ml，B液123ml，混合既得PH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液300ml操作6奶粉中真蛋白含量的测定6.1标准应用曲线的绘制操作步骤：1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组）管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)0

2mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)0－待测液体积(mL)－－－－－－－3.0*蒸馏水(mL)3.01.20.600OD540

2.各管混合后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。4.以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。:6.2样品制备与测定1.称取一定量的奶粉，用蒸馏水将其溶解至饱和2.将100ml奶粉溶液加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至403.用水洗沉淀3次，离心10min(3000r/min)，，弃去上清夜4.在沉淀中加入30ml体积分数95%乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽虑，用乙醇-乙醚混合液（乙醇和乙醚按1：1等体积混合）200ml洗沉淀2次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。5.将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品.6.用生理盐水溶解提取的蛋白质，取3.0ml的待测液与双缩脲试剂反应，再用光分光光度计测其吸光值。6.3分析结果的表述与计算

根据标准曲线，查出对应吸光值的待测液的蛋白质浓度，在乘以稀释的倍数，再计算其质量，再除以奶粉的质量，即得奶粉的蛋白质的质量分数。7.讨论

奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的一项重要指标。目前国内主要采用常规凯氏定氮法，国外也多采用常规或改良的凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，但此法费时、费水、费电，操作繁琐，试剂消耗量大，且不能有效区分非蛋白氮［2、3］。常见的含氮化合物如硝酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氮率都高，易溶于水，很容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常温和冷水状况下在水中的溶解度非常低［4］，但是人们平时习惯上和奶粉说明书上都要求用温开水冲调，例如60℃时三聚氰胺在100g水中可以溶解1.8g，100℃时溶解国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质测定的影响，结果表明：用95%乙醇能很好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高，并能方便、快速测定掺入量。对掺入硫酸铵等无机铵盐的测定，采用加MgO调到弱碱性，直接蒸馏测定［5］。成都理工大学李海玲等通过对Lowry法、BCA法、磺基水杨酸沉淀法、Bradford法等4种常用蛋白浓度测定方法的研究认为，确定PEG-IL-6的最佳蛋白浓度测定方法为BCA法，而包涵体变性液中的蛋白浓度只能用Bradford法测定［6］。中国农业大学食品科学与营养工程学院牛巍等利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸铜沉淀蛋白法对添加了非蛋白氮的液态奶进行蛋白氮测定。结果表明，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮对液态奶蛋白氮测定的影响［7］。河北省衡水市疾病预防控制中心田志梅等分别运用紫外分光光度法及甲醛值滴定法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量。结果显示，两种方法均可有效解决非蛋白质类含氮物质对牛奶中蛋白质测定结果的干扰问题［8,9］。中国农业大学侯彩云等使用三氯乙酸使蛋白质沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，根据其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关关系，用计算机软件自动分析获得的样品色度值，从而计算出蛋白氮含量［10］。

综上所述，目前国内用于测定奶粉中蛋白质含量的方法有多种，其测定原理及结果的准确性各不相同，每种方法都有其优点及局限性。相比较而言，本项目运用双缩脲法检测奶粉中蛋白质的含量，具有简便、快速、实用的特点，可作为检测机构和平时人们快速检测蛋白质含量时考虑运用的方法之一。8注意事项（1）待测样品的吸光度应在标准曲线范围内，否则样品液用蒸馏水稀释再测。（2）实验数据记录、运算时取各组数据平均值，且注意数位的取舍，减少运算误差参考文献1李建武，等.生物化学实验原理和方法.第1版.北京：北京大学出版社，1994，165.2.钱锋张晓非郝艳茹《数理医药学杂志》20