性病实验室操作手册

第一章淋病的实验淋病(gonorrhea)是指由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖道的化脓性感染，如尿道炎、宫颈炎和直肠炎等。如不及时治疗，淋球菌可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起附睾、前列腺、输卵管及盆腔等器官的炎症，甚至可经血液传播到全身其他部位，形成淋菌性关节炎、腱鞘炎、心内膜炎、脑膜炎等合并症。但另一方面，也有5%-20%的男性和60%的女性病人呈现无病症经过。淋球菌好侵犯人类泌尿生殖道的柱状上皮细胞，凭借特异的结构和粘膜外表与之相匹配的部位粘附。继而侵入细胞内增殖，使粘膜上皮破坏，形成炎症，出现一系列病症。一、淋病诊断步骤人类尿道上皮尤其是柱状上皮细胞对淋球菌相当敏感。在感染淋球菌后，经过一段时间的潜伏期(平均3天~5天)。由于细菌和毒素的作用，粘膜坏死、脱落、神经末梢暴露、炎症浸润、组织液渗出，病人会出现尿急、尿痛和尿道流脓等急性尿道炎病症。淋球菌感染男性病人，常会出现尿痛和尿道流脓等临床病症。这时取尿道分泌物作涂片，经革兰染色后，如见到有符合淋球菌形态特征的革兰阴性细胞内双球菌，那么初步诊断阳性，可对病人进行治疗；如涂片查菌阴性，应从尿道取标本进行淋球菌培养。淋球菌感染的女病人，常仅有脓性宫颈分泌物或无病症。对女病人不推荐用涂片法检查，而主张直接从宫颈取材进行培养。标本经培养后，菌落形态典型、氧化酶试验阳性，菌体为革兰阴性双球菌，那么初步诊断为阳性培养物，如有某些性状不符合，那么可进一步用糖发酵试验及直接免疫荧光法等作鉴定加以确诊。二、标本的采集和运送在取材作涂片时，应先用灭菌等渗盐水洗净尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，用棉拭或白金耳蘸取脓液后轻轻涂布于载玻片上。待自然枯燥后作染色。如由男性病人前尿道取材作培养时，应用白金耳或藻酸钙拭子深入尿道2cm~4cm，取出的分泌物应略带粘膜。从女病人的宫颈取材时，应将棉拭插入宫颈口1.5cm，稍转动并停留10s~30s，让棉拭充分吸附分泌物。从肛门取材时，应将棉拭插入肛门2.5cm以上，从紧靠肛环边的隐窝中取材。检查淋菌性咽炎时从扁桃体或扁桃体窝或咽后壁取材。淋球菌对外环境因素如枯燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养成功，应尽量缩短标本离体时间。在医院门诊部，从病人取材后，应立即接种到培养基上进行培养。如取材本处离实验室较远时，可将标本置于无营养性的Stuart或Amies运送培养基或选择性生长培养墓如Trmlsgrow中运送到实验室。标本在无营养运送培养中(在室温25℃条件下)，12h对别离率无影响，在24h内别离大于90%淋病的涂片检查【原理】急性淋菌性尿道炎病人常有大量黄色脓性分泌物。在有些脓细胞内可有许多淋球菌。淋球菌革兰染色呈阴性反响，具有特殊的菌体形态。因此，取病人尿道分泌物制成涂片后做革兰染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作初步诊断的依据。【方法】1．先用灭菌等渗盐水的拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，蘸取脓液后轻轻涂布于载玻片上。待自然枯燥后加热固定，染色，镜检。常用革兰染色，也可用美蓝染色。2．涂片后，待自然枯燥后火焰固定，革兰氏染色：结晶紫染色1min。碘媒染液染色1min。乙醇丙酮脱色1min左右。石炭酸复红复染1min。晾干后油镜镜检。【结果】在急性病人的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞。在有些细胞中吞噬有淋球菌。淋球菌为革兰阴性，呈卵圆形或圆形，常成对排列，接触面扁平或稍凹。菌体长约0.7µm，宽约0.5µm。但两菌大小可有差异。多数多形核细胞中并不含淋菌，但不少脓细胞中常含有一至数对，甚至20对30对淋球菌，淋球菌常存在于细胞浆内。在病期较长的淋病病人的涂片中淋球菌比拟少，有时呈单个、四联和八叠状，位于细胞外。对有些菌有时难以下结论，需进行培养和鉴定。【考前须知】1．涂片时不要用力涂擦，而应将棉拭在玻片上轻轻滚动，因急性病人诊断标准为见到“细胞内革兰阴性双球菌”。涂擦过劲，细胞破裂或变形，菌从细胞内逸出，会造成诊断上的混淆。2．涂片厚薄要适宜。涂片过厚，加之染色过程中脱色时间缺乏，革兰阴性菌也会呈现紫色。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。在大量染片时，最好用一的革兰阳性菌(如葡萄球菌)和阴性菌(如大肠杆菌)作对照。3．固定涂片，只要将涂片迅速通过火焰2~3次，防止加热过度使细胞变形扭曲。当把加热的涂片放到手背上时应不感到太烫。4．不推荐用涂片检查来诊断淋菌性直肠和咽部的感染，也不推荐用作判愈。【临床意义】涂片检查方法简便、有效、价格低廉且有一定的敏感性和特异性。但其特异性随着取材部位的不同而有所不同。例如，从男性尿道取材特异性高，而从女性宫颈取材特异性低。因女性宫颈分泌物中杂菌很多，有的在形态上很像淋球菌。因此，世界卫生组织不推荐用涂片法来检查女性病人。淋球菌的别离培养【原理】如果标本中有淋球菌，那么在适宜的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长成的菌落形态各不相同。根据菌落的大小、外表高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。【方法】1．取材培养要获得成功，取材的部位和方法要准确。由男性病人前尿道取材时，应该用细小棉拭子或藻酸钙拭子或白金耳伸入尿道口2cm~4cm，取出的分泌物应略带粘膜。从女病人的宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器(不要用液体石蜡等润滑油)。应将棉拭插入宫颈口1.5cm处，稍转动并停留10s~30s，让棉拭充分吸附分泌物。从直肠取材时，应将棉拭插入肛门2.2．培养基由于淋球菌的营养要求较复杂，所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌生长所需的各种因子。目前国内常用的是血液琼脂或巧克力琼脂。为抑制杂菌，在培养基中可参加少量抗菌物质如多粘菌素B(25µg/ml)和万古霉素(3.3µg/ml)等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，浓度为8%~10%。但防止血液中参加抗凝剂等药物。培养基的pH值以7.4为好。目前国外常用的培养基有Thayer-Martin(T-M)培养基、NewYorkCity(NYC)培养基和Martin-Lewis(ML)培养基等。T-M培养基是在GC根底培养基中，参加血红蛋白(1%)、抗生素(万古霉素3µg/ml、粘菌素7.5µg/ml和制霉菌素12.5µg/ml)和淋球菌增菌剂，使绝大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大，在乎皿中几乎呈纯培养，从而大大提高了由子宫颈、尿道，尤其是咽和直肠部位别离出淋菌的阳性率。3．培养条件淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和枯燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后应立即接种，标本离体时间越短越好。取材处离实验室距离较远时，应将标本接种于Smart或Amies运送培养基或1%葡萄糖肉浸液中，并注意在运送过程中保温。接种的血平皿应先放在37℃温箱中预温。培养的最适温度为35℃~36℃，超过38.5℃或低于【结果】淋球菌在血平皿上经24h~48h的培养后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，直径为0.5mm~1.0mm。用白金耳触之有粘性。如继续培养，菌落面积增大，外表变得粗糙，边缘出现皱缩。假设从菌落上取材作涂片，可见到菌的大小及染色的深度有差异，排列也不一致，约有25%的菌为典型的双球菌，其他75%为单球菌、四联形或八叠形。淋球菌在液体培养基中生长于液体外表，或稍有轻度混浊和颗粒沉淀。【考前须知】1．培养要获得成功，取材是关键之一。取材的深度一定要够，因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。男性尿道前端包括舟状窝都为复层鳞状上皮覆盖，所以要深人到尿道内2cm~4cm处，并蘸取少量粘膜，阳性率才高。女性病人取材时，要求将棉拭插入宫颈管，转动并停留10s~30s也是这个道理。有些人只在阴道口取少量分泌物作别离培养，阳性率当然会降低，因为有生活力的菌从宫颈随分泌物由阴道流出需一定时间，阴道内pH值低，又因各种杂菌的作用，到阴道口时淋菌的生活力较低，再加上培养过程中各种因素的影响，培养成功的时机就会减少。2．对病症不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后2~3h之后。另外，采样者应熟练掌握前列腺按摩术，必要时作前列腺按摩取材。3．对女性淋病的检查主张用淋球菌培养。国内目前使用血液琼脂参加多粘菌素作抑菌剂效果尚可。但蛋白胨最好用进口的(Oxoid公司产品或日本产或Polypepton等)，并用肉浸液加酵母浸膏等为好。4．国内目前使用的血液琼脂或巧克力琼脂中加人多粘菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌。但由于局部淋球菌(某些地区可高达5%)对万古霉素也敏感，因此，最好不用万古霉素。5．淋球菌在血平板上培养24h，虽能见到菌落，但个儿很小，难以识别其特点。24h~36h，菌落迅速长大。所以观看菌落特征最好在36h左右。超过36h，菌落特征也会有较大的改变。【临床意义】淋球菌培养用作诊断和某些特殊目的。培养法对男性及女性标本都是适用的，是世界卫生组织推荐的筛查淋病病人的唯一方法，也是诊断淋病的金标准方法。初步鉴定试验革兰染色【原理】淋球菌有特定形态。挑取可疑菌落在玻片上制成盐水涂片，经革兰染色，假设见到具淋菌特征形态的双球菌，可作出初步诊断。【方法】在载玻片上加盐水一滴，取可疑菌落制成涂片，枯燥固定后作革兰染色。【结果】可见革兰阴性球菌。菌体为0.7µm×0.5µm大小，呈肾形或卵圆形。约1/4为双球菌，多数为单球菌，个别呈四联或八叠状。与分泌物涂片所见不同，此涂片中无白细胞。【考前须知】涂片厚薄要均匀，革兰氏染色正确，必要时做阴性和阳性对照。陈旧的培养物，涂片颜色结果不典型，应取新鲜培养物。【临床意义】典型革兰氏阴性双球菌说明可能为淋球菌，但必须进一步做试验鉴定。氧化酶试验【原理】淋球菌在生长过程中产生氧化酶。往培养基上生长了24h~48h的菌落上加氧化酶试剂(0.5%~1%新配制的盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液)，淋球菌菌落的颜色可变成紫红乃至黑色。【方法】1．在混有杂菌的淋球菌别离平皿上滴加氧化酶试剂后变成紫红色的菌落为氧化酶试验阳性。2．也可先挑取可疑菌落涂于干滤纸条上，滴加试剂，涂菌处变成红色者为阳性。3．或先滴一滴试剂于滤纸条上(勿太湿)，再涂菌落，观察颜色变化。【结果】淋球菌氧化酶阳性，但氧化酶阳性者并不一定是淋球菌。【考前须知】1．为了保证育良好的反响，所用氧化酶试剂不应过分陈旧。正常的氧化酶试剂(盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺)应为谈红色。如果试剂买来时已成灰色或黑色，说明已失效而不应使用。试剂溶液配好后应放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用一周。2．氧化酶试剂遇铁也会出现红色而造成假阳性，所以操作用的接种环应防止用旧铁丝或电炉丝等制成．并在每次试验前先检查是否末挑茵的接种环接触试剂就有红色出现。3．盐酸四甲基对苯二胺比盐酸二甲基对苯二胺敏感，将一滴盐酸叫甲基对苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快变为深紫色并保存半分钟以上那么为阳性。所以，在测定杜克雷菌等氧化酶试验弱阳性的菌株时，最好用前者。4．如需保存菌种，在菌落末完全变黑时可挑少许转种。菌落一旦变黑，多数菌即告死亡。【临床意义】氧化酶试验试剂易得、操作简便，是淋球菌重要的初步诊断试验之一。标本涂片菌体形态符合淋菌特征，培养长出淋菌菌落，加上氧化酶试验阳性，即可做出初步诊断，开始治疗。如某些性状不符，那么应进一步作确诊试验。确证鉴定试验糖发酵试验【原理】淋球菌有分解葡萄糖的酶类，当它分解葡萄糖时产酸，使培养基的pH值降低，因而培养基中的指示剂颜色改变，如酚红由红变黄，溴甲酚紫由紫变黄。【方法】世界卫生组织推荐的快速非生长的糖发酵微量法操作如下：1．用无选择性的巧克力或哥伦比亚琼脂平皿(含5%马血或羊血)转种受检菌株，以获得纯菌。挑取培养18h~24h的纯菌2满环(直径3mm)混悬于0.3ml~0.4ml缓冲平衡盐指示溶液(BSS)中，制成浓浊菌悬液。每升BSS中含磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钾8g，酚红0.6g，pH值为7.1~7.2。过滤灭菌后储存于4℃2．用5支70mm×10mm小试管，在1管~4管中分别参加20%经过滤灭菌的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖溶液各0.05ml。第5管不加糖(对照管)。3．每管加0.1mlBSS。4．每管加0.05ml菌悬液，充分混匀。在37℃水浴箱中孵育4h【结果】淋球菌发酵葡萄糖，不发酵其他糖。因此，只有葡萄糖管的pH值下降，颜色由红变黄。其他糖管颜色不变。几种奈瑟菌的糖发酵反响情况葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖淋球菌+---脑膜炎球菌++--枯燥球菌+++-Ⅰ型黄色球菌+++-Ⅱ型黄色球菌++--Ⅲ型黄色球菌++--粘液球菌++++卡他球菌----【考前须知】用于糖发酵试验的糖纯度要高〔尤其是麦芽糖中含葡萄糖必须<0.25%〕。最好用进口的分析纯试剂。麦芽糖中混入了葡萄糖，可能产生使人误解的结果。用作试剂的菌要纯。如混有杂菌，会使结果杂乱无章。应该使用18h~24h的淋球菌培养物。如使用超过24h的培养物，可能产生假阴性结果。现已有一些满意的商品化糖发醇试验，如Minitek〔BBL公司〕。做时浸有高浓度糖的纸片放到一塑料凹槽中，参加浓厚菌悬液，孵箱中培养，多数反响发生在4h之内。个别菌株可培养过夜后读结果。缓冲液不适宜或培养在二氧化碳孵箱中，会使所有糖管均变黄。使用胱氨酸胰酶琼脂〔CTA〕作糖发酵试验时，可用接种针将菌种入培养管的上1/3。如将琼脂量由1%增加到1.5%，糖含量由1%增加到2%，那么糖发酵的时间可缩短到4h。如将糖发酵管放到37℃【临床意义】糖发醇试验是淋球菌的鉴定试验之一。确证和区别其它奈瑟氏菌。SPA协同凝集试验【原理】金黄色葡萄球菌的A蛋白具有吸附抗体IgGFc段的特性。因此，挑选金黄色葡萄球菌的某些菌株(有市售)，与淋球菌特异性膜蛋白的小鼠单克隆抗体作用(致敏)，然后用其来检查待检株，如是淋球菌，那么淋球菌菌体抗原和吸附于金黄色葡球菌上的抗淋菌单克隆抗体起作用，单抗又结合着金黄色葡萄球菌，从而产生凝集反响，如待检菌不是淋球菌，那么不产生凝集反响，试验为阴性。【材料】以GonococcalOMNIReagent试剂盒为例，材料包括：协同凝集试剂1瓶。为抗淋球菌抗原的小鼠单克隆抗体(1A和1B)，已结合在灭活的金黄色葡萄球菌上。阴性对照试剂1瓶。为未免疫家兔的血清，也已结合于灭活的金黄色葡萄球菌上,作阴性对照用。试剂的有效期写在标签上。【方法】1．将已经初步诊断为淋球菌的菌落，接种于培养基中，于35℃~7℃(含5%~7%二氧化碳的潮湿环境中)培养16h~242．将生长的菌落在0.5ml等渗盐水中制成1×108菌体/ml的菌悬液。在沸水中水浴5min。为防蒸发水浴时应加盖。3．在试验纸片上加试剂和阴性对照液各1滴。4．在二种试剂上各加1滴经水浴的菌悬液。菌悬液在加之前需充分混匀。5．用一次性环充分混和菌悬液和试剂。每种试剂各用一新环。6．倾斜摇动纸片，在1min内判定结果。【结果】所检菌与试剂起凝集反响者为阳性，和本试剂无反响者为阴性。判定结果之标准为：(4+)：凝集成大块，液体透明；(3+)：凝集成大小不等之团块，液体透明；(2+)：凝集成小团块或小颗粒，液体透明；(+)：凝集成散在细小的颗粒，速度慢，液体不透明；(－)：无明显凝集，液体混浊。以2+以上为试验阳性。【考前须知】1．本试验的敏感性有限。因此，一般用作可疑菌的鉴定，作进一步确诊用。如直接用来检查标本(诊断)，常可因标本中菌量少、杂菌多(尤其是女性标本)而呈阴性。即使本试验阳性，临床医生也不应仅根据单一的试验来作出诊断，而应综合临床和实验室资料后谨慎作出。2．本试验的特异性实际上取决于吸附于金黄色葡萄球菌上的淋球菌单克隆抗体的特异性。特异性强的单抗，可用来区别淋球菌和脑膜炎球菌、枯燥奈瑟菌、微黄奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、粘液奈瑟菌和粘膜炎布兰汉球菌。这些菌都可在无病症者的鼻咽腔粘膜上发现，偶尔可在生殖道粘膜上发现。3．制备菌悬液时，盐水的酸碱度颇为重要，通常要求pH值在7.0~7.5之间。pH值过低会出现非特异性凝集反响。4．为使结果易于观察，可将试剂(金黄色葡萄球菌)染成蓝色。5．实验是稳定的，但观察结果应在1min内判定。试验物干时结果会受干扰。6．为对试验进行质量控制，每次试验应设阳性对照和阴性对照。阳性对照液是一瓶特异的淋球菌纯培养提纯物。如果待检菌不是淋球菌而是其他奈瑟菌，那么试剂和它无反响。阴性结果强烈提示试验不是淋球菌。【临床意义】本试验主要用作淋球菌的鉴定以进一步确诊。另外由于目前已制成抗淋球菌蛋白工、Ⅱ和Ⅲ型的单抗，用它制成不同血清型的协同凝集试剂，因此，本试验也可用于淋球菌的初步血清学分型。淋球菌对药物的敏感性测定方法检测淋球菌对抗生素的敏感性，可用来检测是否产生了耐药株及其比率，为修订淋病治疗方案和制订对策提供重要流行病学资料。K-B法抗生素药敏试验【原理】将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上，药物即扩散到琼脂中。如果淋球菌对此药敏感那么生长被抑制，在纸片周围形成一个透明的抑菌圈。琼脂中药物浓度与纸片距离成反比，距纸片越远药物浓度越小。因而，可根据抑菌圈的大小判定细菌对该药的敏感程度。【方法】用无选择性培养基(如巧克力培养基)再次别离淋球菌。挑取符合标准的淋菌菌落转种，置36℃烛缸培养18h～24h刮取菌苔洗于M-H肉汤中，振荡，获得均匀的菌液。用McFarland比浊管比浊成1×109/ml浓度。用灭菌棉拭蘸取菌液均匀涂布于培养基外表，待干。为使菌液干得较快，可先将培养基平皿在试验前于37℃孵箱中半开盖烤20min~30min用无菌镊子将各种药物纸片紧贴于培养基外表。要求每张纸片中心问的距离不少于24mm。每个90mm的平皿可均匀贴7张纸片。然后放烛缸于350C孵箱或潮湿的含5%～10培养16h～18h(也可24h)观看结果。检查平皿并测量抑菌完全的抑菌圈直径。参照标准报告结果。【结果】淋球菌抑菌圈直径判断标准药物纸片中药物含量抑菌圈直径〔mm〕耐药中间值中间敏感敏感青霉素10IU＜＝26-27-46＜＝47头孢曲松30µg---＜＝35壮观霉素100µg＜＝1415-17-＜＝18四环素30µg＜＝19环丙氟哌酸5µg-＜＝36氟哌酸5µg---＜＝31【考前须知】目前用于治疗淋病的药物可分为7大类，每类药中只要选一种为代表试验，其敏感程度即可代表其他同类药的敏感性。〔1〕青霉素类，包括青霉素C、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素，其代表抗生素是青霉素G；〔2〕四环素类，包括盐酸四环素、强力霉素和二甲胺四环素，代表性抗生素是盐酸四环素；〔3〕壮观霉素类；〔4〕第二、三代头孢菌素，包括头孢甲氧噻吩、头孢呋肟和头孢曲松，可任选一种作敏感性试验；〔5〕氯霉素类，包括氯霉素和甲砜霉素可任选一种作代表；〔6〕氨基甙类抗生素主要是卡那霉素；〔7〕喹诺酮类药包括氟哌酸、氟嗪酸、和环丙氟哌酸，代表性药物是氟哌酸。虽然M-H琼脂用于敏感性试验一般来说是可靠的，但偶尔在某些批号间有显著差异。如果一种批号的培养基不能适合待试菌的生长，扩散试验中所得抑菌圈直径通常变大，可能超出质控范围，而且可以产生错误的结果。应使用培养18h～24h的菌落制成悬液并立即将悬液调至1×108/ml的浓度。为比浊准确起见，应将试管对着白底黑线卡。有些试验装置可使接种物直接标准化而不需调整。在将菌株悬液浓度调整后的15min内，用棉拭蘸菌液在经过烘干的GC培养基整个外表密集涂布。每次将平皿旋转60°，以确保接种物均匀分布。如培养皿涂布满意且接种物正确，那么抑菌圈为一致的圈形，菌在平皿中为融合生长。如为孤立的菌落生长，说明接种物过少。接种后盖上平皿盖放置3min～5min，使多余的水分被吸干，然后再贴药敏纸片。防止接种物过浓，不能用未经稀释的培养过夜和肉汤培养物接种平皿。所用肉汤的pH值应在7.2～7.4。将适宜的药物纸片放于接种菌液的琼脂平皿上，用镊子或针尖将每个纸片轻轻压在琼脂外表以确保完全贴紧。由于某些药物的扩散极快，纸片一旦贴到平皿上就不要再移动。培养16h～18h后，检查平皿并测量抑菌完全的抑菌圈直径〔也包括纸片的直径〕。测量最小达毫米水平，用游标卡、普通尺或特殊的模板来读取结果。在抑菌圈边缘，肉眼勉强可见不明显的细小菌落生长的地方即为判定终点。在明显的抑菌圈内有大菌落生长时应对它传代培养，重新鉴定，并重新试验。抑菌圈通常抡廓清楚，朦胧的微弱生长可忽略不计。7．用于敏感性试验的含药纸片，一般需分开装瓶，包装中须确保防潮。为了长期保需：据药物的性质需冷藏〔8℃或以下〕或－14为了保持纸片的药效，β-内酰胺族的含药纸片需要冻存，少量因工作需要的可在冷藏条件下保存到—周。试验前将冷藏箱或冰柜中未开封的纸片容器取出，放置1~2h使它们与室温平衡，然后再翻开容器，这样可减少热空气与冷的纸片容器发生冷凝现象。当使用—种特殊的纸片分配器时，必须将其盖紧，并附有指示性枯燥剂。在翻开前须使其与室温平衡。当枯燥指示剂变色时应及时更换以免过潮。在不使用的情况下，应将装有纸片的分配配冷藏。纸片应在有效期内使用，已到失效期的纸片应扔掉。【临床意义】纸片扩散法是检测淋球菌对抗生素敏感性的最常用的方法。但纸片法受多种因素影响，结果常不够稳定，不少学者认为，本试验的目的主要是用以指导治疗。“敏感”提示用所试药物以标准剂量进行治疗时失败的可能性＜5%；“耐药”提示临床治疗的失败率＞15%；“中等”结果提示病人用标准剂量的被试抗生素治疗，预期失败率为5%～15%，固而在大局部中度敏感的病人，用较高剂量或延长疗程那么治愈率仍可＞95%。假设对本地区菌株进行系统耐药监测，那么应用琼脂稀释法测定每年菌株的MIC。琼脂稀释法〔MIC〕【原理】将待检菌株种于含有不同抗菌药物的琼脂平皿上，药物浓度h细菌生长，药物浓度高时细菌生长被抑制，据此可测出药物对该菌的最小抑菌浓度，依标准判定菌是否为耐药菌株。【方法】精确称取纯品抗生素，溶于适宜的溶剂中，用蒸馏水稀释后加到培养基中，使培养基中药物的浓度由少到多逐倍递增。对待检菌作初步鉴定之后挑取符合标准的菌落作纯培养，于36℃二氧化碳烛缸中培养24用接种环刮下菌苔，用M-H肉汤制成1×107/ml的悬液。用多头接种器或特制接种环挑取菌液〔约1µl～2µl〕接种到含不同浓度药物的琼脂平皿上。同常规法培养，次日判定结果。【结果】淋球菌对药物的敏感度是指淋球菌不生长的药物最高稀释度。常用µg/ml或mg/L表示。此数值也即该药对此菌的最小抑菌浓度〔MIC〕。世界卫生组织要求监测的药物的敏感度〔青霉素、四环素、壮观霉素、头孢三嗪、环丙氟哌酸〕。【考前须知】1．抗生素应为纯品，应川精密天平称量。2．在制备抗生素贮存液时所用的溶剂随抗生素种类而异。3．根据当地耐药水平的浓度范围，选择制备平板中抗生素的含量。4．含易分解的抗生素(如青霉素)的培养基建议在3天内用完，其他的可用一周。5．应用世界卫生组织A、B、C、D、E五株参考菌株作质控。【临床意义】琼脂稀释法是目前测定淋球菌对药物的敏感度的最为准确的方法，重复性好,结果较为可靠。所获资料可作为对当地流行菌株耐药测定的依据。但MIC在耐药范围的菌株，其产生机理可不同。如对青霉素在耐药范围的淋球菌菌株不一定全是PPNG菌株。PPNG菌株是由质粒介导的产青霉素酶的淋球菌。此外，还有由染色体突变而产生的耐青霉素菌株，它不产生青霉素酶。产青霉素酶淋球菌菌株(PPNG)测定青霉素琼脂法【原理】某些淋球菌菌株获得耐药质粒后产生β-内酰胺酶。该酶能分解青霉素，使培养基的pH值降低，培养基颜色发生改变。【材料】配制培养基(用3000ml烧瓶配制)：琼脂30g加蒸馏水2000ml，用1mol/LNaOH溶液调pH值至10.8，参加0.5%酚红溶液20ml，充分混合后煮沸。检查琼脂是否充分溶解，冷却到50℃，pH值8.5，以无菌手续加人青霉素(600mg)10支(每支先用4ml蒸馏水溶解)充分混匀后倒平皿，每65mm【方法】1．将待测菌株培养过夜。2．用接种环刮取菌苔涂于青霉素琼脂上，约绿豆大小。3．盖盖后于37℃孵箱培养30min【结果】产酶菌株分解青霉素产生青霉噻唑酸使培养基pH值降低，颜色由红变黄。【临床意义】用于检测淋球菌是否为产β-内酰胺酶菌株。碘量法〔β-内酰胺酶测定〕【原理】β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘,破坏了碘和淀粉的蓝色复合物，使蓝色变为无色。【方法】1．将0.25g青霉素溶于41.7mlpH值6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000μg/ml。取0.1ml于一小试管中。2．将培养18h～24h的菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液(109/ml)。3．在37℃水浴中放置30min4．参加1%可溶性淀粉溶液0.05ml，摇动。5．参加碘液0.02ml。6．在37℃水浴中放置10min【结果】在10min内能使蓝色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性，不消褪者为阴性。【考前须知】1．由于青霉素溶液很易分解，因而用于试验的青霉素溶液应新鲜配制。如试验的工作量大，青霉素溶液配成后可分装于试管中，在低温冰箱(－25℃2．淀粉液最好新鲜配制。在100ml,蒸馏水中参加1g可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。贮于冰箱不要超过1周。3．碘液如产生沉淀应新配制。4．试验应按步骤操作，如果碘加得过早，酶反响就会停止，产生假阴性结果。每次试验最好用的阳性菌株和阴性菌株作对照。第二章沙眼衣原体实验室检测沙眼衣原体是引起尿道炎和宫颈炎的重要病原菌。由于70%～80%的女性和多达50%的男性常表现为无临床病症的感染，所以实验室诊断具有重要作用。未经治疗的患者不仅容易传染性伴，同时易引发男性附睾炎，女性盆腔炎和不育症。沙眼衣原体细胞培养【原理】沙眼衣原体是专性细胞内寄生的微生物，它自身不能产生能量，依赖于宿主细胞提供。细胞培养为衣原体的生长提供了必要的条件。选用的细胞为衣原体感染的敏感细胞，使用化学物质或辐射处理细胞，并用离心方法使衣原体接种物易于进入细胞。在适宜的培养条件下，衣原体可在细胞中形成胞浆内包涵体，特异性或非特异性染色后可在显微镜下观察。【材料】〔1〕细胞培养液：每1000ml中含RPMI164016.4g，新生牛血清10%，庆大霉素10µg/ml，万古霉素25µg/ml，制霉菌素25U/ml,HEPES10mmol/L,L-谷氨酰胺2mmol/L,用碳酸氢钠调节pH至7.2；〔2〕标本运送液：每1000ml细胞培养液另加葡萄糖3.〔3〕别离培养液：细胞培养液另加放线菌酮，浓度为1µg/ml；〔4〕无钙镁PBS：每1000ml双蒸NaCl8.0g，KCl0.2g,Na2HPO41.15g,KH2PO4〔5〕胰蛋白酶-EDTA液：每200ml无钙镁PBS中，加胰蛋白酶0.1g,EDTA-Na20.04g〔6〕碘染色液：每50ml蒸馏水中，加KI5.0g，结晶紫5.0g，甲醇50ml；〔7〕碘甘油封固液：等量碘染色液与甘油混合。【方法】1．McCoy细胞单层的制备：将McCoy细胞从液氮中取出，置37℃水浴中迅速融化。将其参加已含有细胞培养液的培养瓶中，待8h细胞贴壁后换新鲜培养液。继续培养2~3天，直至细胞融合成单层。吸去培养液用少量胰蛋白酶溶液清洗单层。加胰蛋白酶-EDTA液消化单层，室温中孵育2~3min，让细胞完全离散，加培养液吹打细胞使之混悬。计数细胞调整McCoy细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔板中，每孔参加0.2ml细胞悬液。微量板孔中预先放入一直径为0.5cm的原形盖玻片,细胞即可在此玻片上生长，5%CO2、36℃培养482．标本的接种：将尿道或宫颈标本加标本液震荡混匀，将单层细胞取出吸取培养液，参加标本液0.1ml。将已接种标本的微量板在35℃、3000g离心1h，弃去标本液，每孔参加0.2ml别离培养液,培养48h3．观察结果：〔1〕碘染色方法：吸去微量板孔中的培养液加0.2ml甲醇于培养孔中,固定10min,弃取甲醇加0.2ml碘染色液,染15min后弃去染色液,加1滴封固液于洁净玻片上,将盖玻片从孔中取出,细胞面向下,放于封固液上显微镜下观察。〔2〕姬姆萨染色方法：甲醇固定后，加0.2ml姬姆萨染色液染30min，吸去染液用磷酸缓冲液洗片后，取出盖玻片，自然枯燥后镜检。【结果】碘染色包涵体染成深棕色；姬姆萨染色包涵体染成深蓝色。【考前须知】〔1〕McCoy细胞浓度应适宜，细胞生长状态好。〔2〕配置培养基的试剂的来源、批号、用量及配置方法应保存好以便追溯问题的来源。〔3〕胎牛血清应符合质量要求。〔4〕放线菌酮的浓度应事先摸索，浓度大对衣原体的生长有影响。衣原体抗原检测〔快速胶体金法〕【原理】衣原体脂多糖抗原与胶体金标记的单克隆抗体结合形成复合物，复合物经虹吸作用而移动，在结果窗被含有的单克隆抗衣原休抗体捕获而形成黑色沉淀线。质控窗含有抗衣原体抗体，无论是否形成抗原抗体复合物，均在质控窗形成衣原体抗体一抗该抗体复合物，黑色沉淀线。【材料】1．抗原提取液2．阳性质控物。3．阴性质控物。4．试验板。5．标本采集管。【方法】1．取材：男性：尿道2~3厘米处取材。女性：宫颈管内l~2厘米处取材，或尿道取材。溃疡部位或腹股沟横痃抽吸液。标本置于运送培养基中，24h接种，超过24h应置于低温冰箱保存。2．标本处理：将拭子置于采集管内，参加提取缓冲液于刻度，80℃水浴10min，放置室温冷却至少5min3．检测：滴加5滴标本提取物于试验板的检测窗，静置15min，读取结果。【结果】质控窗出现一条黑线，表示试验上正常；如无，说明试剂失效。结果窗出现一条黑线，说明试验阳性；如无，试验阴性。结果窗出现一弱黑线，说明结果可疑。【考前须知】1．质控试验：阳性和质控物5滴于采集管，测定同标本。2．该法适合于女性宫颈和男性尿液标本。用于男性尿道标本，结果解释应慎重。3．该法测定阳性，说明存在衣原休，但不能区别微生物的死活，及病人为感染者和带菌者。4．严格按照要求观察结果，注意鉴别非特异性沉淀线。【临床意义】作衣原体诊断的参考。结果阳性表示病人可能有衣原体感染，但需结合临床病症全面考虑。该方法的敏感性较低，适合于基层实验室使用。衣原体抗体测定酶联免疫吸附试验【原理】沙眼衣原体属特异性抗原(LPS)包被酶标板，与血清中衣原体抗体反响后，再通过与酶标抗衣原体抗体结合，形成抗体一抗原一酶标抗体复合物，经底物显色证明衣原体抗体的存在。【材料】①衣原体抗原包被酶标板。②血清稀释液。③标准校正液。④阴性质控液。⑤阳性质控液。⑥酶标结合物。⑦洗涤缓冲液。⑧底物。⑨终止液。【方法】1．血清处理：稀释试验血清、标准校正液和阴阳性质控液1：21(10µl+200µl)，混用。2．试验：所订试剂和标本测定前恢复至室温测定孔阳性对照阴性对照标准校正X2标本l00µl阳性对照l00µl阴性对照100µl标准校正l00µl室温孵育20min，洗板5次酶聚合物l00µll00µll00µll00µl室温孵育20min，洗板5次底物l00µll00µll00µll00µl室温显色10min终止液l00µll00µll00µll00µl450nm酶标读数仪读数【结果】1．平均标准校正值=(OD标准校正1+OD标准校正2)/22．校正因子：见标准校正管。3．cut-off值计算：平均标准校正值X校止因子4．ISR值：免疫状况比率，0D标本cut-off值。3．结果解释：ISR≤0.90阴性ISR＝0.19~1.09可疑ISR≥1.10阳性【考前须知】1．试验前，所有试剂应平衡至室温。2．所有病人的标本利各试剂均按可能含有传染性对待。3．不同批号试剂禁止混用。4．IgC抗体测定不能取代衣原体培养法，不能完全依赖于该结果诊断衣原体的感染。5．假阳性可能发生于其他微生物感染病人，假阴性可能发生于感染的极早期。【临床意义】深部衣原体感染，如LGV、副睾炎、女性盆腔炎或其他感染等，衣原体IgG试验阳性。因为所用抗原为属特异性抗原，故阳性并不能区别为何种衣原体感染，应结合临床病症进行诊断。第三章支原体实验室检测支原体生殖道感染与非淋菌性尿道炎或宫颈炎有关，此外可引起前腺炎、附睾炎、输卵管炎、流产、死产和不育症等。实验室诊断主要采用培养法。由于相当局部正常性活泼人群生殖道中可查到支原体，因此对试验结果的解释应慎重。液体别离培养和鉴定法【原理】解脲支原体(Uu)只有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂Uu液体培养基pH值升高变碱性，液体颜色由黄变红。人型支原体(Mh)只有精氨酸酶，能分解精氨酸产氨，使含酚红指示剂的Mh液体培养基pH值升高，液体颜色由黄变红。【材料】1．液体培养基(配制见附录K)：①Uu液体培养基②Mh液体培养基【方法】1．标本采集：男性标本：用无菌棉拭子插入尿道约2cm处旋转，静止数秒后取材。女性标本：将宫颈口粘液抹去，用无菌拭子插入宫颈管内l~2cm旋转取材。尚可用前列腺液、精液、尿液离心沉淀物作标本。2．接种：将标本洗入单一Uu或Mh液体培养基，或用滤菌器过滤接种。培养：置37℃【结果】液体培养基由黄色变红色，清亮透明无混浊可初步判断为Uu或Mh阳性。【考前须知】取材要准确，尤其女性宫颈拭子，要尽量多取标本。2．取材后应尽快接种，如果有能及时接种，应将标本放入1ml运送保存液中冰箱保存，4℃易失去活力，超过48h应放-703．假设是细菌污染致液体颜色变化，应及时过滤(滤膜孔径0.45µm)后再培养观察是否有颜色变化或转种固体培养基培养，阴性结果应继续观察至第5天。【临床意义】支原体培养阳性，说明有支原体感染，如果患者有临床病症，但其它的病原体检查阴性，那么应考虑支原体引起致病的可能，在部份正常人群中也可以存在支原体。固体别离培养法【原理】支原体接种在固体培养基上，Uu生长具有特征性油煎蛋样微小菌落，而Mh生长具有特征性油煎蛋样菌落(较大)。通过其独特的菌落形态可进一步鉴定。【材料】1．普通固体培养基：(配制见附录1)。2．别离鉴定培养基：A7鉴别培养基(配制见附录1)。【方法】1．液体培养后转种：观察液体培养，当培养基刚开始变红色时，立即转种固体培养基，置于37℃含有5%～10%2．标本直接接种：将标本直接接种于固体培养基，置于37℃含有5%～10%CO3．普通固体培养用Dienes染色(别离鉴定培养基不用染色)低倍镜观察Uu、Mh菌落形态。A7鉴别培养基直接低倍观察。【结果】1．在普通固体培养基上，Uu菌落较小，直径约15～50µm，周边较窄；Mh菌落较大，直径约300～800µm，呈油煎蛋样，中心区较小，周边区宽大呈网状。A7鉴别培养基上，菌落形态同上但Uu菌落呈黑色，Mh菌落根本无色。【考前须知】1．如采用液体培养后转种，因支原体生长繁殖到达顶峰后极易死亡，转种应及时，即当液体培养基刚开始变红时，及时转种固体培养基。2．如无生长，应连续观察5天，并区别其他污染菌。【临床意义】固体培养可以根据菌落的形态进一步鉴别诊断，可弥补液体法产生的误差。纯培养物可用于其他生化鉴定和分子流行病学研究，可进行菌株的保存。支原体药敏试验【原理】选取各试验药物的临界点上下浓度，接种待检支原体菌株，如敏感，那么两种浓度均不生长；如中度敏感，那么高浓度不生长，但低浓度生长；如耐药，两种浓度均生长。【材料】试剂：上述普通液体培养基参加不同浓度抗生素。【方法】标本采集：男性标本：用无菌棉拭子插入尿道约2cm处旋转，静止数秒后取材。女性标本：将宫颈口粘液抹去，用无菌拭子插入宫颈管内1～2cm旋转取材。尚可用前列腺液、精液、尿液离心沉淀物作标本。2．将拭子标本放于保存液中，挤压棉拭子将标本洗到保存液中，把保存液参加冻干的培养基瓶中，充分溶解混匀。3．按要求将—定量的培养基参加到试验条的各个孔中，加1滴石蜡油封盖。4．盖好盖子，于37℃培养，每天观察各孔颜色变化。解脲支原体一般观察48h，人型支原体观察72h【结果】试验条鉴定孔中Uu或Mh培养孔变为红色，清亮透明为阳性。药敏孔中，同一种药物两个不同浓度孔均没有变色为敏感，同一药物两个不同浓度孔均变红色为耐药；同一药物低浓度孔变色，高浓度孔不变色为中度敏感。【考前须知】1．试验药物应为纯粉，药物浓度要准确。2．注意与细菌污染相区别。【临床意义】指导临床用药及支原体耐药性监测。第四章阴道加特那菌实验室检测细菌性阴道病(BV)是由于阴道发生正常菌群失调而致，使乳酸杆菌等正常菌减少，而阴道加特那菌、拟杆菌、胨链球菌和人型支原体过度生长。线索细胞检查一湿片法/干片法【原理】细菌性阴道病时阴道正常菌群发生变化，乳杆菌减少或消失，而阴道加特纳菌、厌氧菌等过度生长。此外，加特纳力和厌氧菌吸附在阴道鳞状上皮细胞外表，使细胞边缘模糊不清呈锯齿状，形成有特殊外观的线索细胞。对阴道分泌物作湿片和涂片革兰染色，在显微镜下可观察线索细胞的有无和百分比多少，以及阴道菌群的变化情况。【方法】1．湿片法：在载玻片上加一滴生理盐水，将阴道分泌物与生理盐水混合成悬液，加上盖玻片后，在高倍(400倍)镜下检查。2．干片法：取阴道分泌物，涂片，作革兰染色，油镜(1000倍)下检查。【结果】线索细胞为阴道鳞状上皮细胞的外表覆盖着许多球杆菌(主要是加特纳菌，有时合并有厌氧菌，革兰染色不稳定)，使细胞呈斑点状、颗粒状外观，细胞边缘模糊不清呈锯齿状。【临床意义】当线索细胞占全部上皮细胞的20%以上时一般认为可诊断BV。湿片法诊断BV的敏感性在80%以上，特异性在90%以上。革兰染色镜检观察阴道上皮细胞中线索细胞的敏感性和特异性高于湿片法，分别为89%利93%。阴道加特那菌别离培养阴道加特纳氏菌以前隶属于嗜血杆菌属或棒状杆菌属，以前称为阴道嗜血菌或阴道棒状杆菌，现为加特纳氏菌属，此菌属只有一个种，即阴道加特纳氏菌(Gardnerellavaginalis)．为研究目的需要进行培养时，推荐用人血双层吐温琼脂(HBT)．【原理】加特纳氏菌对营养要求较高，但不需要X、V因子在普通培养基上不生长或生长不良。在人血琼脂平板上，经35℃于含5%二氧化碳环境中培养48h，可形成0.3～0.5mm大小的，【材料】培养基：人血双层吐温琼脂(HBT)(配制见附录1)。【方法】取阴道分泌物接种于改进人血双层吐温琼脂(HDT)。于35℃含5%二氧化碳环境中培养48h【结果】5%二氧化碳条件下培养48h，阴道加特纳菌表现为直径0.05mm的菌落，圆形、透明至白色，周围有一圈弥散的【临床意义】加特纳氏菌与细菌性阴道病(BV)有关。BV患者的阴道加特纳氏菌的数量增加，在此病人阴道中100%能别离到加特纳菌，本菌还能引起新生儿致死性和非致死性败血症和软组织感染，亦可从阴道脓肿、前庭大腺炎、腹水和咽喉局部离出来。病人的男性性伴中加特纳菌的检出率较高。然而还不清楚此菌是否真的能寄生在男性体内，抑或只是从女性性伴那里获得。许多细菌性阴道炎病人经过有效的治疗，已无明显临床表现时，还能培养到阴道加特菌，因此，不推荐使用阴道加特纳菌的常规培养来诊断细菌性阴道病，也不将此菌的培养用作判愈试验。第五章阴道毛滴虫实验室检测阴道毛滴虫阴道感染，可引起各种阴道炎或无病症的携带者。因为无病症的携带者占50%病例，故临床诊断不能仅靠临床表现。常常要求通过实验室检查来确诊。显微镜形态学检查湿片法【原理】阴道毛滴虫运动活泼，具有旋转式跳动的特有方式。等渗盐水可保持阴道毛滴虫维持寄生于宿主时的形态和运动状态。直接镜检。【材料】1．标本采集：①分泌物：女性取材：用无菌棉拭子从阴道后穹隆处取泡沫样分泌物。男性取材：最好在清晨排尿前采集，刚男性尿道拭子伸入尿道2.5cm以上停留1~2②尿液：收集清晨首次尿或憋4h后的首次尿的前段尿10~20ml送检。③前列腺液：取前列腺液于洁静的载玻片上送检。2．用具：棉拭子、载玻片、盖玻片、窥阴器、灭菌盐水、酒精灯。【方法】将采集标本的拭子放入含有少量等渗盐水的试管内，混匀后吸取一滴于载玻片上或将采集标本的拭子直接涂在滴有盐水的载玻片上。尿液需2000r/min离心15min，离心后取沉渣一滴于载玻片上。盖上盖玻片，于10×/40×显微镜下观察。【结果】等渗盐水湿片中假设有阴道毛滴虫，那么镜下可见梨形或水滴状，无色透明或淡蓝绿色虫体，大小约10~30µm×5~15µm，稍大于白细胞。虫体借助于鞭毛和波动膜作螺旋式跳动，运动活泼。有时亦可见到保护形的滋养体，其形态为外围细胞质增厚，细胞质呈均匀，光润，透明。【考前须知】1．女性取材时所用窥阴器，只能用少量无菌等渗盐水湿润，不可用润滑剂，因为一些润滑剂对阴道毛滴虫的活动有影响。2．从取材到观察的时间间隔越短越好，否那么易影响滴虫的活动性或虫体受到破坏使检查结果受到影响。3．注意标本的保温，尤其冬季气温较低，影响阴道毛滴虫的活力。【临床意义】滴虫检查阳性，结合临床表现，即可做出初步诊断，应及时治疗。此法简便、快速，是门诊的常规检查方法。涂片染色法【原理】分泌物涂片作染色检查，可以清楚地看到虫体形态和内部结构，还能观察到阴道的微生物相、清洁度和细胞组织相。【材料】同湿片法【方法】1．涂片：将标本加少量生理盐水涂成薄片，置室温自然枯燥。2．固定：用酒精灯火焰固定或甲醇固定。3．染色：革兰氏染色4．油镜观察结果。【结果】革兰染色时，滴虫易受涂片时的挤压变形，可呈多形性，如梨性、圆形、长圆形、多角形等；大小差异较大，介于白细胞的2~3倍至鳞状上皮细胞的1/2之间；虫体轮廓清楚，胞浆稍呈嗜酸性，疏松泡沫状，有紫红色长圆形细胞核，多在偏心位置，并偶见1~4条鞭毛，而滴虫的波动膜及轴柱难于着色，不易见。【考前须知】1．涂片染色受多种因素影响，上述虫体典型结构并非完全可见。2．涂片过程、染色过程的挤压等闲素，可造成虫体大小悬殊，形态多形性，但是长圆形的细胞核，疏松且有空泡的细胞质，及偶可见到的4根前鞭毛具有一定的特征性，不难识别。【临床意义】滴虫检查阳性，结合临床表现，即可做出初步诊断。有利于鉴定，并可长时间保存和利于教学。阴道毛滴虫培养【原理】阴道毛滴虫能在人工培养基中生长。由于滴虫对培养的要求不太高，因此一般供培养原虫的培养基也可用于滴虫的培养，但在任何培养基内均需参加血清，因为血清中含有滴虫生长所必需的生长因子。滴虫是厌氧生物，它在管底生长良好，为了降低氧的张力，可在培养基中参加复原剂(如半胱氨酸)。培养基中参加抗生素是为了杀灭其他微生物以获得较为纯洁的滴虫。【材料】培养基：能够用于培养阴道毛滴虫的培养基很多，常用效果较好而使用简便的培养基有：肝浸液培养基，Diamonds培养基(配制见附录1)，血清简易培养基，Johson氏CPLM培养基，简化胰蛋白酶培养基以及国外商品化的Kupferberg培养基〔Difco和BBL〕和Feinberg培养基(Oxoid)。【方法】培养阴道毛滴虫的最适温度为37℃，最适pH5.8~6.0。因其为厌氧生物，培养基在培养前应隔水煮沸5~10min以驱氧，它在管底生长得最好。培养步骤：将所取标本直接放入培养基中，置37℃温箱培养48h，用无菌滴管伸入管底吸取0.05ml培养物作悬滴法或染色法检查，如为阴性，应继续培养至6【结果】可用悬滴法及染色法镜检，可见有特征性运动方式和染色形态的阴道毛滴虫。【考前须知】1．培养法是检查阴道毛滴虫最为敏感的方法，常用于无病症感染(主要指滴虫数量少)，或有病症但涂片检查为阴性者以及男性滴虫病的诊断，同时也可用于寻找敏感药物以及药物治疗效果的动态观察等。2．本法阳性率可高达98%。但因操作较麻烦，不作为常规检查，主要用来检查轻症病人，带虫者，慢性患者和科研需要作诊断和疗效观察的依据。3．阴道毛滴虫是厌氧性原虫，故每管培养基的量相对要多，一般在15mm×l50mm试管内约需分装培养基9~4．在培养基中参加抗生素后，可获得滴虫的纯培养，但培养时间也要相对有所延长，故培养观察时间应延长至6~7天。5．为了获得供实验用的滴虫虫株，临床别离的虫株需传代保存。刚从病人体内别离的滴虫开始在培养基中生长不良，每天需转种一次，一周后每2~3天转种一次，经2~3周后，虫株就适应了人工培养环境，生长良好。6．一般情况，标本采集后应立即送检。无条件立即送检需较长时间转送时，可直接接种于Diamonds培养基或血清简易培养基中，置室温保存。至少可存活24h以上。运送到实验室后，先放入37℃温箱培养24~48h【临床意义】临床标本中由于滴虫的数量少，一般常规涂片染色检查不易检出，通过培养的方法可使虫体增殖，数量增多，提高检出率，多应用于在科研或药敏筛查。阴道毛滴虫抗菌素敏感性试验(MIC)【原理】在滴虫培养基中将抗菌素作不同浓度的稀释，然后将一定浓度的滴虫种入，定量测定抗菌素对滴虫的最小抑菌浓度(MIC)。【试剂】1．Diamonds培养基抗菌素【方法】1．排列试管10~15支，每管参加Diamond：培养基3ml，自第二管起将药物原液参加试管中作系列倍比稀释，浓度应适合当地的耐药水平。第一管为对照管。2．取一定量的滴虫悬液，加滴虫悬液于各管内，每管0.3．各管置35℃孵育24~48h【结果】滴虫不生长的最小浓度管的浓度为最小抑菌浓度。【考前须知】1．用于试验的药物不应含有赋形剂，要求纯度要高，需用精密天平称取。2．同时应做阴性和阳性对照。3．观察时间一般48h，以对照为准。【临床意义】指导临床用药和流行病学研究。第六章念珠菌实验室检测念珠菌属阴道内正常菌群，绝大多数女性表现为无病症带菌，局部可开展成为有病症的疾病。男性病人临床表现为龟头炎或前列腺炎。对于病症不典型的女性病人和男性念珠菌感染往往需要实验室诊断。念珠菌的湿片检查湿片法【原理】10%KOH可保持念珠菌在组织内的形态，并使菌丝及孢子具淡绿色折光，如观察到孢子，芽生孢子及假菌丝，即可作为诊断依据。【材料】1．标本的采集：①分泌物：女性：用灭菌棉拭子从阴道后穹隆处取分泌物。最好取奶酪样或豆渣样白色凝块。男性：用灭菌钝刀蘸取少量灭菌生理盐水，刮取龟头或阴茎包皮，取分泌物及皮屑。尿道感染者用尿道拭子缓慢伸入尿道内2~4cm处驭材。②尿液：收集清晨新鲜中段尿10~20m1，以2000r/min离心15min后，取沉渣涂片。③前列腺液：前列腺按摩，无菌取材。④龟头皮屑：钝刀刮取皮屑或湿棉拭子用力擦拭。2．用具：载玻片、盖玻片、洒精灯、窥阴器、灭凶棉拭子、连柄钝刀。3．试剂：复方KOH(10%)KOH10g二甲基亚砜40m1甘油20m1蒸馏水加至100ml【方法】加1滴10%KOH于载玻片上，将采集标本直接涂在KOH溶液中，盖上盖玻片，置酒精灯火焰微加热，直接10×或40×镜检。【结果】念珠菌阳性者镜下可见略带淡绿色折光的假菌丝和成群的卵圆形孢子或芽生孢子，孢子直径3~5µm。假菌丝节间有明显的狭窄部，偶可见到分隔的真菌丝。结果报告为“假菌丝及芽生孢子阳性”。有时仅有孢子而无假菌丝，可能为其他酵母菌感染，应报告为“芽生孢子阳性”。皮屑直接镜检可见菌丝和孢子，报告时应写为“菌丝、孢子阳性”。【考前须知】(1)采集标本方法要正确，标本量要多。(2)念珠菌性阴道炎、龟头炎的病人，仅有分泌物或伪膜而无鳞屑的病人，可直接用等渗盐水涂片作检查，这样可以直接用玻片上的标本做真菌培养。(3)念珠菌性龟头炎的病人，如有鳞屑应滴加10%KOH溶液，促进角质溶解，增加透明度，以利于检查。干片革兰染色法【原理】分泌物涂片染色后，念珠菌的假菌丝及芽生孢子可染成革兰阳性，更利于检出，同时还可以观察有无其他微生物及细胞组织。【材料】灭菌生理盐水、革兰染液【方法】1．标本采集方法同10%KOH镜检法。2．涂片：将所采集标本加少量盐水制成薄片，室温自然枯燥。3．固定：用酒精灯火焰固定．4．革兰染色，油镜观察。【结果】经革兰染色后假菌丝及芽生孢子或孢子均被染成革兰阳性(紫色)，假菌丝的狭窄部及孢子芽生的特征明显，易于观察。【考前须知】革兰染色法检查念珠菌比KOH法、湿片法敏感性高，特异性高，尤其对生殖器念珠菌的分泌物，婴幼儿皮肤念珠菌感染的检可，这些标本多见芽生孢子，少见假菌丝，革兰染色比KOH法更易查到孢子。【临床意义】涂片显微镜检查的阳性率较其他方法高，但只要检查阳性，即可确诊。该法具有准确率高，所需设备简单，出报告快等特点。但阴性时不能完全排除感染，仅凭镜检也不能确定为何种念珠菌感染，需作念珠菌培养鉴定。念珠菌别离培养【原理】念珠菌在沙保葡萄糖琼脂基上生长良好。将分泌物标本用棉拭子采集后直接涂在培养基外表，24~48h生长出较大的乳白色菌落。【材料】沙保葡萄糖琼脂培养基(配制见附录1)【方法】1．标本接种：沙保葡萄糖琼脂培养基，35℃培养2~2．涂片革兰氏染色，镜检。【结果】24h培养后，念珠菌菌落为奶油色、闪光、软而平滑。革氏染色镜检可见阳性芽生孢子。【考前须知】念珠菌和酵母菌同时可在GC或TM培养基上生长，但生长较慢，菌落小，呈灰白色。TM培养基中含有抗真菌药物，可能导致有些念珠菌不生长。【临床意义】培养结果阳性，可见念珠菌，可确诊念珠菌感染，尤其对于男性念珠菌性前列腺炎，龟头炎等。菌株可进一步鉴定到种。念珠菌的鉴定试验芽管试验【原理】白色念珠菌在血清中形成芽管，而其它念珠菌不能形成。【材料】血清：小牛血清或新鲜人血清，经56℃水浴1h【方法】加0.2m1血清于无菌试管中，接种少量念珠菌培养物，混匀后置37℃【结果】念珠菌菌体长出芽，长约为菌体3~4倍，宽为菌体1/2。【考前须知】1．血清应新鲜。2．其它念珠菌，星形念珠菌和热带念珠菌的某些菌种也可产生芽管，但其形态较宽、短。【临床意义】该法是快速鉴别白色念珠菌的常用方法之一。特异性75%。厚壁孢子形成试验【原理】在25℃【材料】玉米吐温80琼脂培养基：(配制见附录1)。【方法】无菌盖玻片及载玻片置于无菌空平皿内，滴加溶化的玉米吐温80琼脂1滴于盖玻片上，凝固后，用接种针将待鉴定菌从紧贴盖玻片处穿刺接种到培养基，用镊子将盖玻片翻转，有培养基的面贴在载玻片上，置于湿盒内，25℃培养48h【结果】在菌丝顶端有厚壁孢子生长。【考前须知】星形念珠菌也可产生厚壁孢子，但其位置多数不在顶端，而是在菌丝中间。【临床意义】该法是快速鉴别白色念珠菌的常用方法之一。糖发酵试验【原理】念珠菌能发酵糖类产酸，使培养基pH降低，指示剂颜色发生改变。【材料】糖发酵培养基【方法】将待检菌接种于各糖发酵培养基中，25℃培养48h【结果】发酵糖产酸时培养基变成黄色。【考前须知】1．试验用糖纯度要高，否那么影响结果。2．不同念珠菌糖发酵能力不同。【临床意义】该法是念珠菌菌种鉴定的常用方法之一。根据不同的生化反响，可区别不同念珠菌。念珠菌药敏试验【原理】选取各试验药物的临界点上下浓度，接种试验念珠菌菌株，如敏感，那么二浓度均不生长；如中度敏感，那么高浓度移植生长，但低浓度不生长；如耐药，二浓度均生长。【材料】1．半固体沙氏培养基。2．带有各种抗真菌药物的反响板条。【方法】将待检菌接种于半固体沙氏培养基，混匀后，按要求加到药敏反响孔中，置于25℃培养，24~48h【结果】试验孔中念珠菌生长那么培养基变混浊。同一种药物两个不同浓度孔均没有变混浊为敏感；同一药物两个不同浓度孔均变混浊为耐药；同一药物低浓度孔变混，高浓度孔不变混为中度敏感。【考前须知】1．试验药物应为纯粉，药物浓度要准确。2．菌液浓度应按照试验要求配制，浓度过高或过低均影响结果。【临床意义】指导临床用药，念珠菌耐药性监测。第七章梅毒螺旋体实验室检测梅毒是由梅毒螺旋体引起的慢性感染性疾病。梅毒螺旋体可以通过性接触和胎盘等方式传播。梅毒螺旋体不能够在体外培养，也不能用常规方法染色。实验室常用的检测方法包括典型溃疡处查找梅毒螺旋体和检测血清中抗体的存在。不同的感染阶段应选用不同的实验室方法，溃疡并不是出现于疾病任何阶段，而抗体一般在溃疡形成后1～4周出现。梅毒螺旋体暗视野显微镜检查法【原理】非染色的梅毒螺旋体在暗视野显微镜下，当光线从暗视野聚光器边缘斜射到标本中，螺旋体呈现发光的具有螺旋状及特征性运动方式。【材料】1．暗视野显微镜。2．钝刀、无菌盐水、载玻片、盖玻片、注射器等。【方法】1．取材：①皮肤粘膜损害部位取材：先在玻片上加无菌盐水1滴，用棉拭子擦去皮损部位污物，如有痂皮，可用钝刀除去，嘱患者用手挤压皮损周围，使组织液渗出，用钝刀轻轻地刮取组织液(防止出血)，将组织渗出液与玻片上无菌盐水混合，加盖玻片后镜检。②淋巴结取材：消毒淋巴结外表皮肤，用1m1注射器配12号针头，吸取0．25～0.5ml无菌盐水，以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，如此反复二三次，取少量淋巴液直接滴加于玻片上加盖片后镜检。③羊膜穿刺术：梅毒孕妇的羊膜穿刺术应由专业人员操作，获得羊水直接滴加于玻片，加盖片后镜检。2．显微镜检查：①翻开暗视野显微镜，在聚光器上加一滴蒸馏水(湿式)。②将玻片置于载物台上。③上升聚光器使蒸馏水接触玻片的底部，先用10倍物镜调焦，再用40倍物镜观察。【结果】在暗视野显微镜下，如有发光的典型螺旋状梅毒螺旋体及特征性运动方式(旋转运动、伸缩移行、弯曲前行)为阳性结果。【考前须知】1．聚光器的高度应适当，以背景较暗物象清晰为好。2．应多取组织液提高阳性率，但要尽量防止出血。3．取材后立即观察，以免影响活力。4．注意梅毒螺旋体的特征及运动方式，以鉴别其它螺旋体。5．暗视野未发现梅毒螺旋体，不能排除梅毒感染，应稍后复查或做血清学检查。【临床意义】1．暗视野检查可作为梅毒诊断确实证试验。假设发现梅毒螺旋体，即可确诊为梅毒感染。2．此法特别适用于血清学试验阴性的早期梅毒诊断。梅毒螺旋体抗体血清学检查〔初筛试验〕不加热血清反响素试验(USR)【原理】USR是一种改进的VDRL(性病研究实验室试验)试验方法，将配制的VDRL抗原(主要心磷脂)经离心后的沉淀物悬于乙二胺四醋酸(EDTA)、氯化胆碱及磷酸盐缓冲液中。EDTA可稳定VDRL抗原不易变性，氯化胆碱可将血清灭活。当抗原与梅毒血清中抗体(主要IgG、IgM)混合时，可产生非特异性抗原抗体反响形成肉眼可见的凝集夥粒，即为阳性反响。【材料】1．USR试剂盒①USR抗原。②直径为14mm一次性塑料(玻璃)反响板。③45±1滴/ml标准针头。④USR反响结果标准照片。2．可调水平旋转器。【方法】1．定性试验①吸取50µl血清放入反响板圈内，并均匀涂布整个圈。②将USR抗原轻轻摇匀，用标准针头吸取抗原，每个标本中加1滴抗原液。③将反响板置旋转器旋转4min，(180±5)r/min。④立即用肉眼或显微镜观察结果。【结果】根据凝集反响絮状物大小判断阳性程度强阳性(3＋～4+)：大或中等大小的絮状物，溶液清亮。阳性(2+)：絮状物比拟小，悬液较清亮。弱阳性(1+)：絮状物比拟小，均匀分布，液体混浊。可疑(±)：抗原颗粒较粗一般属于阴性反响。阴性(－)：抗原颗粒均匀，针状细小。2．定量试验①正反响板圆圈内参加50µl等渗盐水(一般做6个滴度，有必要者应继续稀释)。②吸取50µl血清加到第一孔混匀后，再吸取50µl至第二孔稀释，依此作倍比稀释(1:2～1:64)，最后所稀释的圆圈内应弃去50µl③每个圆圈加1滴抗原混匀，将反响板置旋转器旋转4min，(180±5)r/min。观察结果同定性试验。④记录出现1+阳性反响的最高血清稀释倍数，即抗体效价。快速血浆反响素环状卡片试验(RPR)【原理】RPR试验是VDRL试验的一种改进方法。该试验是在USR抗原中参加碳颗【材料】1．RPR试剂盒①RPR抗原。②直径为18mm圆圈的特制白色反响卡片。③60±1滴/ml标准针头。2.可调旋转器。【方法】1．定性试验①吸取50µl血清或血浆放在白色卡片圈内，并均匀涂布整个圈内(每张卡片有10个或12个反响圈)。②将RPR抗原轻轻摇匀，用标准针头吸取抗原，每个标本中加1滴抗原。③将卡片置旋转器旋转8min，(100±5)r/min。④立即在明亮光线下观察结果。【结果】阳性：圆圈内出现小至大的黑色絮状物为阳性，不分其阳性的程度。必要时可以依絮状物的大小和多少，用“+”号表示。阴性：圆圈内仅见碳颗粒集于中央一点或均匀分散为阴性。2．定量试验①在纸卡圆圈内参加50µl等渗盐水(一般做6个滴度，超过者应继续稀释)。②吸50µl血清或血浆系列稀释(1:2～1:64)，最后所稀释的圆圈内应弃去50µl。③滴加1滴抗原混匀，旋转时间、速度、观察结果同定性试验。④记录出现1+阳性反响的最高血清稀释倍数，即抗体效价。甲苯胺红试验〔TRUST〕【原理】TRUST试验原理与RPR试验原理相同，唯TRUST抗原中参加甲苯胺红染料颗粒代替碳颗粒作为指示物，使阳性结果出现红色絮状凝集现象，阴性结果甲苯胺红颗粒聚集于中央一点或均匀分散。【方法】TRUST试验方法同RPR试验。【结果】TRUST试验结果判断同RPR试验。【考前须知】1．实验环境适宜温度为23℃～29℃；抗原应保存在2．校准针头，RPR、TRUST等抗原(用9号针头)为60±1滴/ml，USR抗原(用12号针头)为45±1滴/m1。一般试剂盒内已有配套专用针头。3．用旋转式摇床，不用平衡式振荡仪。4．试验完毕，立即观察结果。5．为防假阴性，试验最好用纯血清。6．初筛试验阳性特别是初诊患者，应做确证试验以排除生物学假阳性。7．防止出现“前带”现象，对可疑者应将血清稀释后测定。【临床意义】初筛试验是非特异性抗原抗体反响，早期梅毒硬下疳出现1～4周后可呈阳性，经治疗后血清抗体滴度下降并可转阴性，故可以作疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。梅毒螺旋体抗原血清学试验(确证试验)梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)【原理】用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏红色明胶颗粒与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见红色凝集反响。【材料】1．溶解溶液A：用于溶解致敏颗粒C和非致敏颗粒D。2．血清稀释液B：用于稀释血清标本。3．致敏颗粒C4．非致敏颗粒D5．对照用阳性血清E6．U型反响板【方法】〔1〕吸取B液100µl参加第8孔，B液25µl分别参加第1、2、3、4、5、6孔中；〔2〕血清稀释：吸取待检血清25µl放入第8孔，混匀后吸取25µl到第1孔，重复其稀释步骤至第6孔时，混匀后弃去25µl液体；〔3〕滴加致敏和未致敏颗粒：混匀细胞工作液，第2孔加25µl未致敏颗粒；第3、4、5、6孔加25µl致敏颗粒；颗粒参加完毕，将反响板置微量振荡器上振荡30s，置湿盒内，15℃～25℃孵育2h【结果】阳性2+～4+：颗粒凝集覆盖整个孔底，多边形膜状，边缘粗糙。阳性1+：颗粒凝集呈多边形性粗糙大环状。可疑±：颗粒浓集呈边缘光滑小环状。阴性－：颗粒聚集在孔底中央、光亮、边缘光滑。定量试验以出现阳性反响(1+)的最高稀释度作为最终滴度。【考前须知】1．TPHA、TPPA反响板要清洁干净，孔内无异物，以防止假阳性。要用U形板，不能用V形板。2．试剂盒不可置0℃3．试验温度适宜15℃～254．如未致敏细胞出现凝集反响，应做重吸收试验或改用其他确诊试验方法。【临床意义】1．TPPA试验具有敏感性高、特异性强，是梅毒诊断较好确实证试验。2．TPPA试验阳性患者，由于记忆细胞抗体复制能力强，特异性试验敏感性高，即使经抗梅毒治疗也终生阳性，因此不能作为治疗效果观察的指标。但根据临床观察，早期梅毒患者血清如TPPA试验为弱阳性反响，随时间延长可能转阴。3．特异性试验对一期梅毒可比非特异性试验早一周出现。梅毒过程中最初出现的是IgM体，梅毒感染后第2周即可从血清测出，而IgG抗体那么需在感染后第4周方可出现测出。4．梅毒确证试验，一般定性试验阳性，那么可作梅毒诊断依据，必要时做定量试验。经有效治疗后特异抗体滴度也可不同程度下降，但转阴时机甚少。此类试验特异性强，很少出现假阳性。但据统计，也可以有1%生物学假阳性存在。荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)【原理】FTA-ABS试验是检测梅毒确实证试验，原理是将灭活的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂(用Reiter螺旋体制备而成)吸收的梅毒血清或免疫血清，反响形成抗原抗体复合物，再参加荧光素(FITC)标记的抗人免疫球蛋白(IgG、IgM)反响形成荧光素抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，梅毒螺旋体显示苹果绿色荧光。【材料】1．螺旋体抗原片：每片载玻片有假设干个圆圈(不同厂家数量不同)，圈内涂有梅毒螺旋体。2．吸收剂：用体外培养的Reiter株螺旋体制成。3．用荧光素标记羊或鼠抗人免疫球蛋白。4．封固剂5．阳性对照血清【方法】1．血清标本于56℃灭活30min2．冻干吸收剂按要求溶解后用于血清稀释。3．试验血清和吸收剂按1:5稀释，混匀后置有盖湿盒内于37℃吸收30min4．将l:5稀释的血清(必要时吸收后的血清用吸收剂或PBS作1:20、1:80、l:320稀释)加到抗原片的圆孔(以敷满整个孔为宜)，置于有盖湿盒内，