环境中微生物的检测和分离纯化

生72伍国羽2007012357 环境中微生物的检测和分离纯化生72伍国羽2007012357组别周四班2-1-1实验同组人：王甦实验时间2010年4月16日实验目的熟悉常用微生物培养基配制与灭菌方法和原理;掌握微生物的分离,纯化;用平板划线法和稀释法分离微生物;认识微生物存在的普遍性，理解无菌操作原理.实验原理微生物聚集最多的地方是土壤，土壤是各种微生物生长繁殖的大本营。空气里悬浮着无数细小的尘埃和水滴，它们是微生物在空气中的藏身之地。各种水域中也有无数的微生物。居民区附近的河水和浅井水容易受到各种污染，水中的微生物就比较多。大湖和海水中，微生物较少。从人和动植物的表皮到人和动物的消化道，也都经常生活着大量的微生物。平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。实验器材实验材料:菌源:土样10g，大肠杆菌；牛肉膏蛋白胨培养基24个；实验仪器:取液器:1000ul、200ul各一支，培养箱；实验试剂:0.9%无菌生理盐水，250ml三角瓶中装99ml生理盐水，每瓶加约20粒玻璃珠；250ml三角瓶中99ml生理盐水，作100倍稀释用。实验用具：平皿，涂棒，无菌200ul，1000ul吸头，记号笔，酒精灯。实验步骤采土样：选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深度的土壤数10g,装入烧杯,带回实验室;制备土壤稀释液;称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。(全班统一做1份,分到每个小组1ml)。用200ul的无菌吸头从中吸取0.1ml土壤悬液，注入事先分装有0.9ml无菌水的试管中，吹吸3次，摇匀（10-3）。类推制得10-4、10-5、10-6的土壤悬液。涂布。用无菌吸头，分别吸取10-6、10-5、10-4浓度土壤稀释液100ul，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板，编号为1、2、3。涂板。单菌落划线（2块）：用接种环挑取大肠杆菌液，做单菌落划线分离，每人2板。手指（1块）：分别用未洗过的手指头,用自来水打湿的手指头，用自来水洗过的手指头，用洗手液洗过的手指头(不用毛巾擦)在同一平板的不同分区涂抹（用力一致）。头发（1块）：放置一根头发，用无菌图布棒压紧在培养基上。空气（2块）：打开培养皿置实验台上（空气中）10min，按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min。豆浆（1块）：用永和豆浆涂板。泡菜水（1块）：用前次实验制作泡菜的腌制水涂板。培养。将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于35℃温箱中培养24h；统计所长出的菌落数。统计结果实验结果与讨论土壤中微生物计数。实验结果如下表1所示：表1土壤稀释液微生物计数结果稀释浓度菌落数平均值微生物浓度（个/g土壤）12310-418无法计数无法计数181.8X10610-5无法计数7无法计数70.7X10710-630无法计数1.51.5X107实验得到的菌落数较少，都偏离300太多，故误差较大，三组得到的结果差别比较大。由于天气尚寒冷，土壤中菌量还比较少，应该使用更浓的土壤溶液涂板观察计数。实验中发现大部分平板都无法计数，菌落部分长成了一片或者长得有较多菌落连在一起。这是涂板没有涂匀的结果。实验中使用的平板是新倒上凝结即时使用的，故含水量比较多，菌液滴加到培养基上不容易被培养基吸收，故涂板涂了很久之后依然有液体依附在培养基表面和涂布棒上，这样长出来的菌就会形成一片的菌斑。而如果菌液剩余不多，粘附在涂布棒上，当将涂布棒拿离培养基的时候就会留下一条菌液痕，会长出条状的菌斑。建议实验改进为提前一天由助教倒好一半数量的平板，课堂上同学们学习倒另一半数量的平板使用，这样也可以对比看到含水量较多的平板和含水量较少的平板的区别。单菌落划线图1.大肠杆菌单菌落划线。用接种环挑取大肠杆菌液，做单菌落划线分离，可以看到在菌液越来越少，在第四次划线时出现了单菌落。手指细菌测试图2.手指上细菌测试。分别用未洗过的手指头（1区）,用自来水打湿的手指头（4区），用自来水洗过的手指头（2区），用洗手液洗过的手指头（3区）(不用毛巾擦)在同一平板的不同分区涂抹（用力一致）。（注意标号是反的）可以看到未洗过的手指头涂抹的区域菌落最少；用水打湿后菌落稍微有几个；用自来水洗过的手指头菌落密度和用洗手液洗过的几乎一样，菌落都非常多，而且有两种，一种为白色，一种为黄色菌落。这并不表明没洗过的手指头最干净。由于没有水，所以干的指头上的菌很难落下来到平板上，所以细菌都还粘在手指上。用水沾湿后会有少量的细菌脱落下来。而用水洗和用洗手液洗下的菌的密度相当。单就细菌来讲，如果手上没有明显的污垢，用清水清洗会比用洗手液洗更健康，因为洗手液里的化学物品会伤害皮肤。同时，洗手后应该把水擦干更健康。头发细菌测试图3.头发上细菌测试。放置一根头发，用无菌图布棒压紧在培养基上。可以看到头发上的细菌不算很多，只有几个菌落。发现不管用桌子的黑底或者白纸的白底，都没法将非常小的菌落拍的太清楚，而且如果相机里板子太远会没法拍清楚，离得太近又挡光，依然拍不清楚很小的菌落。而且非常容易拍到灯光的高光点，导致看不清菌落。实验中发现将平板竖起来，以白纸为背景但又不贴着白纸的时候可以将小菌落拍的非常清楚，而且此时相机与平板在一个水平线上，不会挡住平板的光线，这样即使有高光点也依然能拍到菌落的阴影，看的非常清楚。空气中落菌情况图4.空气中细菌含量的测定。打开培养皿置实验台上（空气中）10min，然后培养过夜看平板上长菌情况。可以看到打开了10分钟后平板上落菌量并不多。说明实验室的空气细菌比较少。按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min。此块平板未长菌，说明实验中所使用的无菌操作方法是可行的。永和豆浆中细菌测定。用100ul永和豆浆涂板后培养观察其平板菌落情况。实验中此块平板未长菌。说明永和的豆浆卫生状况非常好。但有的同学做的出来的用豆浆涂的平板长满了菌落，这有可能是由于他们使用豆浆涂板的时间比较晚，豆浆已经凉了放置了过长时间，里面已经开始生长细菌了。本组实验使用的豆浆都是热的很新鲜，做了2块平板用豆浆涂板都没有长菌。泡菜水中细菌含量的测定。图5.泡菜水中细菌含量的测定。用100ul泡菜水涂板后培养观察其平板菌落情况。可以发现平板上的菌落都比较小，但数量比较多。但在制作泡菜时为无氧发酵，所以这些好氧菌即使在瓶口处的泡菜水中少量存在也不会繁殖，故不会影响泡菜的质量。思考题你所取的土壤中细菌数量级为多少？土壤中细菌数量级为107。从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操作应注意什么?无菌操作暴露无菌部分在空气中的时间必须要短，暴露时需在酒精的的火焰旁边。注意有菌的部分尽量不要接触到无菌的部分。实验前需洗手并且擦干。进行接种、划线和涂布操作的前后涂布棒和接种环应在火焰上彻底灭菌，涂布时在酒精灯火焰处操作，打开培养皿的程度要尽可能小，涂棒能够伸入涂匀即可。倒培养基时打开培养瓶后瓶口需在酒精灯上略加灼烧。说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性;从本次实验中看到手上存在大量微生物，其中有对人体有害的致病菌，而残存在牙缝中的牙垢也适宜微生物生长。洗手、刷牙可使清除手上微生物和牙垢，防止有害微生物在手上大量存在或在牙齿缝隙中大量生长，非常重要。在日常生活中如何讲究饮食卫生?饭前洗手,饭后刷牙，食物清洗干净；餐具定期进行消毒；不食用过期或者因长期存放可能已经被污染的食品，生、熟食分开存放，分刀具、砧板操作，生食要清洗干净，熟食要加热彻底等等试解释夏天时煮好的饭如果放在锅中保持盖着锅盖不动，不容易变质，而一旦盛在碗里的饭就容易变质，如果是吃剩的剩饭就最容易变质的原因。蒸煮过的饭中不少细菌已经被杀灭，在不开锅盖的情况下，和外界基本隔离，所以不容易受到外界环境中微生物的污染，因而不容易变质。盛在碗里，和外界环境直接接触，就容易被空气中的细菌污染，容易变质；吃剩的饭之前与人的唾液、餐具均有长时间接触，已经含有大量、多种微生物，变质速度最快。根据实验结果，试批驳“洁僻行为”。从本次实验的结果来看，我们日常生活所处的环境中含有各种各样的微生物，即便是在洗的非常干净的手或者器物上，都含有大量的微生物。不论采取多么小心的卫生习惯，也不可能完全清除或者杀灭这些细菌，在正常情况下，由于人体本身的免疫系统具有较强的抵御能力，这些微生物的存