《鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规范》

鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规范     范围本文件规定了鸭疫里默氏杆菌病诊断的术语和定义、临床诊断、病原菌的分离培养、病原菌的鉴定与结果判定、生物安全。本文件适用于鸭疫里默氏杆菌病的诊断、检疫、监测及流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer）属黄杆菌科，有荚膜，无芽孢、无鞭毛、不运动的革兰氏阴性菌。多数菌体呈杆状或椭圆状，大小为0.3~0.5μm×0.7~6.5μm，个别菌体呈长丝状，可达11.0~24.0μm。部分菌体表面有芽状赘生物。鸭疫里默氏杆菌病（Riemerellaanatipestiferdisease）是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种接触性\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"传染性疾病，又称为\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"败血症、鸭疫综合症、\t"/item/%E9%B8%AD%E7%96%AB%E9%87%8C%E9%BB%98%E6%B0%8F%E6%9D%86%E8%8F%8C%E7%97%85/_blank"鸭疫巴氏杆菌病等，特征性病理变化为全身浆膜表面覆有广泛性的纤维素性渗出物，以肝周炎、心包炎、气囊炎最为常见，还可引起脑膜炎、关节炎和输卵管炎。临床诊断流行病学鸭、鹅、火鸡等多种禽类易感，自然条件下2~7周龄雏禽易感，其中以2~3周龄雏禽最易感。种禽和成年禽很少发病，但可成为传染源。本病主要经呼吸道或皮肤伤口感染，还可通过种蛋垂直传播。环境气候改变、饲养管理不当、饲料变质或营养不均衡、运输等应激因素均可诱发该病。临床症状最急性型发病急、病程短，死前无明显症状。急性型常见于2~4周龄的雏禽，病程1~3日。病禽表现为精神沉郁，缩颈，嘴拱地，步态不稳，共济失调，频频点头，食欲衰减，咳嗽、打喷嚏，眼和鼻有分泌物；排黄白色或绿色粪便，病鸭死前颈震颤，角弓反张。慢性型常见于4~7周龄雏禽，病程在一周以上，主要表现为神经症状，如斜颈、转圈、倒退等。耐过禽生长发育缓慢，生产性能低下。病理学变化纤维素性肝周炎肝脏肿大，质脆，呈棕黄色或土黄色，表面被覆有灰白色或淡黄色的纤维素膜，易剥离。纤维素性心包炎心脏肿大，心包积液，心外膜表面可见黄白色纤维素性分泌物和出血点，与心包膜粘连。纤维素性气囊炎气囊壁浑浊、增厚，有灰白色纤维素性渗出物附着，与胸腹壁粘连。纤维素性脑膜炎脑膜充血、水肿、增厚，部分脑膜上覆有纤维素性渗出物，脑实质淤血。关节炎关节液增多，乳白黏稠。干酪性输卵管炎输卵管膨大，横切可见内含豆腐渣样的白色干酪样物质。结果判定若发病鸭符合4.1流行病学、4.2临床症状和4.3病理变化，可判定为鸭疫里默氏杆菌病疑似病例。病原菌的分离培养样品的采集、保存与运输组织、脑、血样、积液等病料样品的采集、保存与运输按照NY/T541的要求执行。细菌分离培养接种无菌条件下进行。用消毒后的剪刀处理组织病料，露出切面，用无菌接种环自切面处伸入组织内部，划线接种于普通琼脂平板、血琼脂平板和含5%新生牛血清的胰酶大豆琼脂平板。平板的配制按照GB/T4789.28的规定操作。液体样品直接划线。培养接种后的平板在37℃、厌氧环境（含5%CO2的厌氧培养箱、烛缸或含厌氧产气包的厌氧培养缸）中倒置培养24~48h。菌落形态观察与结果判定菌落在普通琼脂平板上不生长，在血琼脂平板上呈灰白色、不溶血，在胰酶大豆琼脂平板上呈圆形、透明、边缘光滑整齐、有淡蓝色荧光，可判定为鸭疫里默氏杆菌疑似菌落。病原菌的鉴定与结果判定生化鉴定生化试验按GB4789.28中规定的方法配制生化发酵管。挑取符合5.2.3特征的疑似菌落，接种发酵管后于37℃恒温培养24~48h。结果判定记录生化试验结果。若疑似菌落的生化特性与表1中一致，可确认该菌为鸭疫里默氏杆菌。鸭疫里默氏杆菌生化反应结果生化试验项目反应结果生化试验项目反应结果乳糖－甘露醇－VP－甲基红－硫化氢－尿素酶+硝酸盐－氧化酶+靛基质－明胶+PCR检测方法与结果判定模板制备挑取符合5.2.3特征的疑似菌落，加到含有100μL生理盐水的1.5mLEP管中，100℃煮沸10min，10000rpm离心2min，取上清作为DNA模板。引物序列检测基因是鸭疫里默氏杆菌高度保守的热休克蛋白编码基因groEL（GenBank登录号：GU060633）。上游引物序列：5ʹ-GGGAGACGCACTTAAAAGAGGTG-3ʹ；下游引物序列：5ʹ-CCTTCTCTCACGATAGCTTGC-3ʹ。扩增片段大小为271bp。反应体系每个样品建立25μLPCR反应体系，见表2。鸭疫里默氏杆菌参考菌株（ATCC11845）的基因组作为阳性对照，无菌双蒸水作为阴性对照。鸭疫里默氏杆菌groEL基因扩增体系配置表试剂名称加样体积（μL）2×TaqPCRMasterMix12.5上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1DNA模板2灭菌去离子水8.5共计25.0PCR反应条件预变性95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min，结束反应，4℃保存。PCR产物电泳配制1.5%的琼脂糖凝胶，添加工作浓度的核酸染料。取5μLPCR产物进行电泳，同时用DNAMarker作为分子量参考。用凝胶成像系统观察分析