尼达尼布对肺泡上皮细胞间质转分化的作用及机制研究

尼达尼布对肺泡上皮细胞间质转分化的作用及机制研究目的:探讨尼达尼布是否通过影响VEGF/TGF-β1/Notch1信号通路抑制肺泡上皮细胞间质转分化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT),进而抑制肺纤维化(pulmonaryfibrosis,PF)的发生与发展,从而为PF的治疗提供了理论依据。方法:雄性SD大鼠52只,随机分为对照组、博来霉素(Bleomycin,BLM)组、BLM+尼达尼布(50mg/kg)剂量组、BLM+尼达尼布(100mg/kg)剂量组,每组12只。采用气管内注射博来霉素(5000U/kg)来建立大鼠的肺纤维化模型。造模后连续灌胃给药四周,对照组和模型组在相同环境下给予相等体积(1mL/100g)生理盐水。HE和Masson染色分别观察肺组织病理变化及胶原沉积情况。免疫组织化学法检测肺组织转化生成因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(collagenI)蛋白的阳性表达情况。大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN)随机分为5组:Control组、血管内皮生成因子(VEGF,10ng/mL)组、VEGF+尼达尼布(1、10、100nmol/L)剂量组。细胞用VEGF预处理1h,再加入不同剂量的尼达尼布处理48h。Realtime-PCR检测肺组织及(或)细胞collagenI、III型胶原(collagenIII)、α-SMA、波形蛋白(Vimentin)、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密结合蛋白(ZO-1)、VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA的表达情况。Westernblot分析肺组织及(或)细胞中collagenI、collagenIII、Vimentin、α-SMA、ZO-1、E-Cadherin、VEGF、TGF-β1、Notch1蛋白表达情况。结果:1.动物实验(1)HE染色结果显示正常组的肺组织肺泡结构无明显破坏,无明显炎症反应。与正常组相比,BLM组的大鼠肺泡结构破坏严重,炎性细胞浸润,肺组织发生实质性病变,肺泡间隔变宽,成纤维细胞显著增生。与模型组相比,尼达尼布各组给药四周后上述病理变化明显减轻。(2)Masson染色结果显示正常组的肺组织肺泡结构无明显改变,肺间质仅有少量胶原表达。与正常组相比,BLM组肺泡间隔明显增厚,肺间质胶原沉积明显增多,而不同剂量尼达尼布连续给药28天后肺组织胶原沉积明显减轻。免疫组化、real-timePCR及Westernblot检测发现,与对照组相比,模型组的大鼠的肺组织中collagenI、IIImRNA及蛋白表达明显上调(P<0.01);与BLM组相比,尼达尼布各剂量组的肺组织collagenI、collagenIIImRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。(3)免疫组化、real-timePCR及Westernblot检测发现,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中Vimentin、α-SMAmRNA及蛋白的表达明显上调(P<0.01)而E-cadherin及ZO-1mRNA及蛋白的表达明显降低(P<0.01);与BLM组相比,尼达尼布各剂量组的肺组织α-SMA、VimentinmRNA及蛋白的表达明显降低(P<0.05或P<0.01)而E-cadherin及ZO-1mRNA及蛋白的表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。(4)免疫组化、real-timePCR及Westernblot分析发现,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.01);与BLM组相比,不同剂量尼达尼布能明显下调肺组织VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。2.细胞实验(1)Real-timePCR和Westernblot结果显示,与Control组相比,VEGF组TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与VEGF组相比,不同剂量尼达尼布组TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白的表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。(2)与Control组相比,VEGF组中Vimentin、α-SMAmRNA和蛋白均出现不同水平的上调(P<0.01)。而ZO-1和E-Cadherin的mRNA和蛋白均出现了不同水平的下降(P<0.01)。与VEGF组相比,不同剂量尼达尼布组Vimentin,α-SMA的mRNA和蛋白表达均不同程度的下调,而ZO-1和E-Cadherin的mRNA和蛋白表达均不同水平的上升(P<0.05或P<0.01)。(3)与正常组相比,VEGF组collagenI、collagenIIImRNA和蛋白表达明显上调(P<0.01);与VEGF组相比,不同剂量尼达尼布组collagenI、collagenIIImRN