关于靶向ASGPR的反义核酸体外抗HBV作用

关于靶向ASGPR的反义核酸体外抗HBV作用

【摘要】目的研究以宿主基因ASGPR为靶的反义核酸的抗-HBV作用，为HBV感染的用药提供新的思路。方法以HepG212115细胞为靶细胞，脂质体为载体将靶向ASGPR的硫代反义寡核苷酸(ASODN)转染至HepG212115细胞中，72h后收集细胞培养液，采用酶联免疫法及荧光定量PCR法测定细胞培养液中HBsAg、HBeAg。结果结果表明，随着浓度的升高，ASODN抗HBsAg，HBeAg和HBVDNA的作用逐渐增强。当ASODN高于0.5μmol/L.时作用逐渐减弱。结论ASODN具有抗HBsAg，HBeAg和HBVDNA的作用。【关键词】寡核苷酸反义乙型肝炎病毒【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsagainstHBVofaphosphorothioateantisenseoligodeoxynucleotide“ASODN”targetedtoASGPRinvitro.TheassayattemptedtoaccessanewmethodandideatorefreshthethinkingwayabouthepatitisBtreatmentbytheASODNtargetedtoasialoglycoproteinreceptor(ASGPR).Methods(ASGPR)mRNAwassynthesizedUsingHepG212115cellasthetargetcell，ASODNwastransfectedintoHepG212115cellbylipofection.Thecultureswereincubatedfor72h.Thencellmediawerecollectedanddetected.HBVDNAlevelincellmediumwasexaminedbyreal-timePCR.HBsAgandHBeAgweredetectedbyELISA1.ResultsOurResultsshowedthatASODNshowedanadditiveeffecttowardstheinhibitionofHBsAg，HBeAgandHBVDNAWiththeincreasingofASODNconcentration.TheeffectdecreasedgraduallywhenthelevelofASODNconcentrationhigherthan0.5μmol/L.ConclusionItisconcludedthatundercertainexperimentalconditions，theASODNisapowerfulanti-HbsAg，anti-HbeAgandHBVDNA.【Keywords】antisenseoligodeoxynucleotideshepatitisBvirus乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高[1]。乙型病毒性肝炎以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。少数患者可转化为肝硬化或肝癌。，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病[2]。血清中HBsAg阳性是HBV感染的标志[3，4]。本身具有抗原性，无传染性。HBeAg为HBV复制的重要指标[5，6]。在于乙肝表面抗原阳性血液中。HBV-DNA阳性是表示HBV复制的最可靠指标[7]。近年用多聚酶链反应（PCR）这一体外DNA扩增技术，可测出极微量的病毒.反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide）通常指进行了某些化学修饰的短链核酸（约15-25个核苷酸组成），它的碱基顺序排列与特定的靶标RNA序列互补，与靶标基因的RNA结合后可通过各种不同的机制影响靶标基因的表达[8]。反义寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一种研究基因功能的重要工具。大多数药物属于靶标基因（或疾病基因）的抑制剂，因此反义寡核苷酸模拟了药物的作用.在靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸本身还可以被进一步开发成为反义寡核苷酸药物[9，10]。去唾液酸糖蛋白受体(AsialoglycoproteinReceptorASGPR)是肝细胞的一种重要且高效的内吞受体，主要分布于肝小叶门静脉周围肝细胞的窦面膜上，又名肝凝集素(liverlectin).，ASGPR的主要生理功能是负责清除去唾液酸糖蛋白、凋亡细胞和脂蛋白等。在肝脏基因定向转移、靶向药物治疗当中具有较高的应用价值[11]。以往研究表明，根据去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor，ASGPR)基因mRNA的二级结构设计并筛选出的反义寡核苷酸(anti2senseoligodeoxynucleotide，ASODN)，能有效地抑制HepG212115细胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA[12].，本实验以HepG212115细胞为模型，观察ASODN的抗-HBV作用。1材料与方法1.1细胞培养HepG212115细胞由本实验室保存，用含10%胎牛血清(FBS，Gibco)，380μg/mlG418(Promega)的MEM细胞培养液置37℃，5%(体积分数)CO2孵箱培养。1.2试剂Lipofectin购自美国Invitrogen公司，乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司，乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司。1.3寡核苷酸的制备ASODN(5′2CCTCCCAGGACGT2GACCACC23′)由ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，用MicroPureⅡ反向纯化柱(OligoPrepOP120，SAVANT)纯化。1.4HepG212115细胞给药在96孔板中，每孔加入含6×103个HepG212115细胞的100μl的细胞培养液，置37℃，5%CO2孵箱培养72h。用Lipofectin按照其说明书进行A2SODN转染。ASODN终浓度为011μmol/L、012μmol/L、014μmol/L。分别取ASODN的3个浓度(011μmol/L、012μmol/L、014μmol/L)，每个重复3个孔。以不给药组作为空白对照组。继续培养72h后收集培养液，-20℃保存备用。1.5寡合甘酸药对HepG212115细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用检测将收集好的培养液按照乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(华美生物工程公司)，乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(华美生物工程公司)说明书操作。各取50μl培养。液加入表面抗原及e抗原包被的96孔板中，再加入50μl相应的酶标结合物，37℃孵育1h。相应洗液洗板5次，再依次加入50μl显色液A及50μl显色液B，37℃避光显色15min，最后加入50μl终止液。在多标记酶联免疫检测仪(VIC2TORTMWallac1420MultilabelCounter，Wallac)上测定450nm处1s吸光值A。根据IR=(A450对照-A450给药)/A450对照计算抑制率。1.6对HepG212115细胞分泌HBVDNA的抑制作用检测将收集好的培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法[13]操作。定量检测HBVDNA的引物序列为，P1:5′2GGAGTATGGATTCGCACTCCTC23′;P2:5′2TTGTTGTTGTAGGGGACCTGCCT3′。荧光探针序列F:5′2ACTTCCGGAAACTACTGTTAGACGA23′;淬灭探针序列Q:5′2GTAGTTTCCGGAAGT3′。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针Q，200μmol/LdNTP，410mmol/L的Mg2+，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为:94℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环，反应后由电脑自动计算出定量结果。2结果2.1寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制2.1.1.寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBsAg的抑制。从表1中可以看出，随着ASODN浓度的增加，对HBsAg的抑制率增强。ASODN取0.5μmol/L时对HBsAg的抑制率达到最高峰，取0.6μmol/L和0.7μmol/L时对HBsAg的抑制率逐渐下降。2.1.2寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBeAg的抑制随着ASODN浓度的增加，对HBeAg的抑制率增强。ASODN取0.4μmol/L时对HBeAg的抑制率达到最高峰，为31.1%，后随着浓度的升高，对HBeAg的抑制率逐渐下降（表1）。2.1.3寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBVDNA的抑制ASODN取0.5μmol/L时对HBVDNA的抑制率达到60%，为最高峰，后随着浓度的升高，对HBVDNA的抑制率逐渐下降（表1）。表1ASODN对HBsAg，HBeAg和HBVDNA的抑制作用Table1TheinhibitiveeffectofASODNagainstHBsAg，HBeAgandHBVDNA3讨论抗病毒是乙肝治疗的关键，口服抗病毒药物以拉米夫定为代表，在中国上市10年，积累了丰富的经验。临床应用的免疫调节可以提高抗病毒免疫[14]。目前抗病毒药物，效果都不十分满意[15]。应用后可暂时抑制HBV复制，停药后这种抑制作用消失，使原被抑制的指标又回复到原水平。有些药物作用较慢，需较长时间才能看到效果。HBV基因组虽为双链环形DNA，但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。乙型肝炎抗病毒治疗，其关键在于药物能否抑制HBV的超螺旋共价闭合环形DNA(cccDNA)，而现有抗病毒药对肝细胞核中病毒cccDNA无作用。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor，ASGPR)是数量丰富的一种主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面的