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文档简介
植物DNA的提取与纯化
DNAextraction实验一1精选完整ppt课件实验原理植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求:1.DNA的纯度可以满足下游操作的要求2.DNA必须完整3.DNA应当有足够的量构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。如果对植物进行大规模筛选,操作程序应当快捷,简便,价格低廉,并尽可能避免使用有毒试剂。2精选完整ppt课件核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把蛋白质和糖去除,同时除去RNA及无机离子等,从中分离DNA。
3精选完整ppt课件核酸的提取方法提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法,对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。4精选完整ppt课件实验材料和试剂实验材料:新鲜植物组织。100mmol/LTris-HCl(pH8.0)50mmol/LEDTA500mmol/LNaCl1.5%SDSDNA提取缓冲液实验所需试剂:24:1/氯仿:戊醇其它试剂:液氮、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇。2×CTABbuffer100mMTrispH8.01.4MNaCl20mMEDTApH8.02%CTAB0.2%巯基乙醇酚/氯仿(1:1)
氯仿:50ml无水乙醇5精选完整ppt课件实验仪器6精选完整ppt课件实验步骤:取新鲜叶片约3g,剪碎,加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中;2.在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入NaBisufite,混匀并调pH至8.0;3.在管中加入适量提取液,60℃水浴保温约30min,不时颠倒混匀;
4.冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇,用力摇匀后,放置摇床上摇动15min左右;5.室温下10000rpm离心15min,小心吸上清于新的离心管中,加入两倍体积的冷酒精,-20℃放置1h或过夜;6.挑出DNA置于新的管中,挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精,摇动洗涤10min,重复洗涤2-3次;
7.吹干DNA,加入适量TE在65℃溶解,完全溶解后离心去除杂质;
加入RNase(10mg/mL),室温处理0.5-1h,
除去RNA,4℃或-20℃贮存。
如需纯化DNA,再加入适量TE,氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清,加入3ml/LNaAc和两倍体积的乙醇,-20℃放置1h或过夜;吹干沉淀后,加入适量TE,65℃溶解,4℃或-20℃贮存。
7精选完整ppt课件1.植物叶子约3g,剪碎置预冷研钵中
加入液氮充分研磨,注意不能干磨混合球磨仪8精选完整ppt课件3.60℃水浴保温30-60min9精选完整ppt课件加入等体积氯仿,用力摇匀10精选完整ppt课件6.再次10000rpm离心5min;
将上清小心吸入新的离心管中;
11精选完整ppt课件DNA样品在1%Agarose胶上电泳(例图)
12精选完整ppt课件实验注意事项微量移液枪的使用一定要规范,吸取氯仿等有机试剂要注意
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