急性低氧暴露对棕色田鼠脑组织p53基因表达的影响

急性低氧暴露对棕色田鼠脑组织p53基因表达的影响地下鼠(subterraneanrodents)除了耐低氧(hypoxia)、高二氧化碳(carbondioxide)和对黑暗环境(darkenvironment)的适应等特性外,大多还具有抗肿瘤的特性,例如,裸鼹鼠(Heterocephalusglaber)和盲鼹形鼠(Spalax)均具有很强的肿瘤抑制(tumorsuppressor)特性。有关地下鼠抗肿瘤的分子生物学研究,主要集中于肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)p53及其调控的分子通路方面。p53基因可诱导细胞周期停滞(cellcyclearrest),并修复受损的DNA或促进细胞凋亡(apoptosis)。无论DNA修复还是细胞凋亡,均可降低低氧对地下鼠重要组织(例如脑组织)的伤害。上述两条通路被认为是地下鼠肿瘤抑制的分子调控通路,受低氧或者DNA损伤的诱导。本论文通过在形态学、组织学以及分子生物学方面,采用比较生物学方法,以棕色田鼠(Lasiopodomysmandarinus)为实验动物,布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)为实验对照,确定个性化与体重变化的关系、脑组织海马区CA1区域细胞凋亡和肿瘤抑制基因p53和HIF-1a的表达情况,旨在探索棕色田鼠肿瘤抑制的分子生物学机制。主要结果如下:1.急性低氧暴露后复氧对体重变化的影响采用视频自动分析软件Smart3.0,测定24只棕色田鼠和24只布氏田鼠的个性化(personality),选择其中个性化得分在0.2-0.6的24只个体(棕色田鼠和布氏田鼠各12只)作为实验动物,用于复氧后体重变化的实验。可重复测量的双因素方差分析(repeatedmeasurementsANOVA)结果表明,1)无论是在低氧还是在常氧处理下,棕色田鼠和布氏田鼠的体重变化趋势相似。即棕色田鼠低氧组、棕色田鼠常氧组、布氏田鼠低氧组、布氏田鼠常氧组等4组动物的体重均呈现先降低后恢复的现象(P=0.015),低氧暴露显著地降低了两种鼠的体重(P=0.038),而鼠种之间(P=0.956)或者鼠种与低氧处理间的交互作用(P=0.394)则均不显著。2)棕色田鼠和布氏田鼠的体重变化与其个性化得分间相关性不显著(棕色田鼠:y=3.5195x-11.672,R2=0.0373,P=0.71;布氏田鼠:y=0.6768x-8.3354,R2=0.0041,P=0.91),说明实验中选择动物的个性化范围较好,低氧处理对两种鼠的作用强度相近,能够很好用于后续组织学和分子生物学的研究。2.急性低氧暴露后复氧对p53和HIF-1α基因表达的影响通过提取18只棕色田鼠和18只布氏田鼠脑组织总RNA、反转录成cDNA、获取序列、设计引物、引物验证、与相近物种多序列比对、构建进化树,以及对物种间HIF-1α和p53的表达量比较,并且应用相对定量法,以β-actin为管家基因对数据进行分析。双因素方差分析结果表明,1)不同复氧时间对棕色田鼠和布氏田鼠的HIF-1α表达量的影响达到极显著差异(P<0.01),两种鼠的HIF-1α表达量均呈现先上升后波动下降恢复的现象。鼠种和不同复氧时间的交互作用达到极显著差异(P=0.002),鼠种之间的HIF-1α表达量达到极显著差异(P=0.003)。2)棕色田鼠HIF-1α出现的时间晚于布氏田鼠,两种鼠HIF-1α表达量在复氧12h达到高峰,说明低氧暴露后布氏田鼠脑组织较快呈现缺氧状态,两鼠均在复氧12h时脑组织表现为高度缺氧。3)不同复氧时间对棕色田鼠和布氏田鼠的p53表达量的影响达到极显著差异(P<0.01),棕色田鼠的p53表达量先呈上升趋势,在复氧12h时p53表达量达到高峰,然后呈下降趋势,而布氏田鼠p53表达量在整体上没有变化趋势。鼠种和不同复氧时间的交互作用达到极显著差异(P<0.01),鼠种之间无显著差异(P=0.996)。4)棕色田鼠HIF-1α表达量与p53表达量之间存在极显著的正线性关系(r=0.836,P<0.01),说明脑内缺氧可以诱导p53的表达。3.急性低氧暴露后复氧对海马区CA1细胞的影响选择18只棕色田鼠和18只布氏田鼠作为实验动物,采用TUNEL法染色、倒置显微镜观察,选用脑组织海马区CA1区域做石蜡切片,并在40×10的放大倍数下,对凋亡细胞进行计数。双因素方差分析结果表明,1)不同复氧时间对棕色田鼠和布氏田鼠脑组织海马区细胞凋亡的影响达到极显著差异(P<0.01),棕色田鼠和布氏田鼠的凋亡细胞均呈现先上升后下降恢复的现象。鼠种和不同复氧时间之间的交互作用达到极显著差异(P<0.01),但是鼠种之间未有显著差异(P=0.898)。2)棕色田鼠凋亡指数在复氧24h达到高峰,布氏田鼠凋亡指数在复氧12h达到高峰,说明棕色田鼠凋亡高峰出现的时间晚于布氏田鼠,低氧胁迫对布氏田鼠的影响较早,损伤时间较早。3)棕色田鼠HIF-1α和凋亡细胞呈极显著的负相关关系(P=