普通菜豆抗普通细菌性疫病田间鉴定技术规范

1DB14/T1367—2017普通菜豆抗普通细菌性疫病田间鉴定技术规范本标准规定了普通菜豆抗普通细菌性疫病田间鉴定的术语和定义、接种体制备、田间抗性鉴定、病情调查、抗性评价、接种鉴定后材料处理、鉴定记载表。本标准适用于普通菜豆对普通细菌性疫病的田间抗性鉴定及评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是比不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2060.1辣椒抗病性鉴定技术规程第1部分：辣椒抗疫病鉴定技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1普通菜豆豆科（Leguminosae蝶形花亚科（Papilionoideae菜豆族（Phaseoleae菜豆属（Phaseolus）中的一个栽培种，一年生草本植物，学名PhaseolusvulgarisL.。英文名为Commonbean。染色体2n=22。3.2菜豆普通细菌性疫病由地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种（Xanthomonasaxonopodispv.phaseoli）引起的以叶部形成有亮柠檬黄色边缘包围的不规则病斑，病斑合并导致大面积组织损伤，使叶片坏死、脱落，病株呈灼烧状为主的菜豆细菌性病害。该病害在菜豆的整个生育期内均可发生，病菌可侵染叶片、茎蔓、豆荚及种子等产生不同病症。病原菌的生物学特性情况见附录A。3.3抗病性田间鉴定将一定浓度病原菌悬浮液直接接种到田间植株的叶片、果实、茎秆及根等部位，依据植株的发病情况进行抗病性鉴定。4接种体制备4.1病原物的分离、纯化及保存2DB14/T1367—2017采集具有典型病斑的菜豆叶片或病荚，采用常规组织分离方法在牛奶吐温选择性培养基（成分及制备见附录B）上分离病原物。分离物经菌落形态鉴定确认为地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种后，进行分离物纯化，经致病性测定后，在4℃低温下保存备用。4.2接种体选用地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种作为抗病性田间鉴定的接种体。4.3接种体的繁殖和保存4.3.1繁殖将纯化的菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基（成分及制备见附录C）中，在28℃、200r/min条件下振荡培养48h，用灭菌蒸馏水稀释至菌液浓度为1×108cfu/mL，接种悬浮液用于田间接种。4.3.2保存挑取病原菌的单菌落接种于装有1mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的菌种保藏管中，在28℃、200r/min条件下振荡培养过夜。离心后，加入50%灭菌甘油，在-80℃低温下保存备用。5田间抗性鉴定5.1鉴定圃选择鉴定圃选择在普通细菌性疫病常发区，该区排灌方便、土地平整、肥力水平中等以上。5.2鉴定圃设计适期播种，鉴定材料随机或顺序排列，3次重复；每份材料播种5m2，行长5.0m，行宽0.5m，每行留苗35株，株距约0.15m。鉴定圃周围设保护行或保护区。5.3鉴定对照品种每10～15份鉴定材料设1组已知抗病、感病对照材料。抗病对照品种为“洋菜豆（F0001292）”，感病对照品种为“黑金豆（F0001585）”。5.4接种时期植株生长到第1片三出复叶至开花期前期均可接种。5.5接种方法人工接种鉴定采用喷雾接种法。用喷雾器对叶片上、下表面均匀喷雾，接种至整个植株完全湿润。5.6接种后管理接种后田间应充分灌溉，保证病菌的入侵、扩展。接种前后避免施用任何药剂。6病情调查6.1调查时间3DB14/T1367—2017病情调查于接种后20d进行。6.2调查取样每个重复中的每份鉴定材料棋盘式取样，田块均匀划成8个小区，均匀间隔取4个小区，每区随机取5株，共调查20株。6.3调查部位植株叶片和荚的外部症状。6.4病情级别划分接种植株病情分级及其相对应的症状描述见表1。表1病情级别划分0135796.5调查及计算根据病害症状描述，调查每份鉴定材料接种单株的发病情况，确定病情级别，并计算每份鉴定材料的病情指数（DI）。按公式（1）计算病情指数：DI=Σ(Ni)根100 式中：DI——病情指数；Ci——病情级别；Ni——各病情级别的植株数；N——调查总植株数。7抗性评价7.1鉴定有效性判别4DB14/T1367—2017当感病对照材料达到其相应感病程度（DI＞50），该次材料的抗病性鉴定为有效。7.2抗性鉴定评价标准依据病情指数3次重复的平均值评价各鉴定材料的抗性水平，划分标准见表2。表2抗性评价标准8接种鉴定后材料处理8.1将接种后剩余的接种体集中灭菌处理。8.2将鉴定后的田间病株集中焚烧。9鉴定记载表普通菜豆抗普通细菌性疫病鉴定结果记载表应符合NY/T2060.1的要求，具体见表3。表3普通菜豆抗普通细菌性疫病鉴定结果记载表013579ⅠⅡⅢ5DB14/T1367—2017A（资料性附录）菜豆普通细菌性疫病病原菌A.1学名地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种（Xanthomonasaxonopodispv.phaseoli）A.2生物学特性病原菌属好气性革兰氏阴性菌，极生单根鞭毛，杆状，菌体长0.5μm～3.0μm，宽0.3μm～0.8μm，有荚膜，不产生芽孢。在含碳源的固体培养基上形成圆滑、黄色、黏稠状菌落。生长最适温度为30℃,最高为38℃,致死温度为50℃,10min。酸碱度范围为pH5.7～8.4，最适为pH7.3。能液化明胶，使石蕊牛乳变蓝并凝固；不能液化果胶凝胶，不产生果胶酶。在含有乙酸的培养基上生长的细胞具有乙醛酸循环的酶类，能产生类似细菌素的物质。6DB14/T1367—2017B（资料性附录）牛奶吐温选择性培养基B.1成分10g示蛋白胨（Oxoid）、0.25g无水氯化钙、0.5g酪氨酸、15g琼脂粉、10g脱脂奶粉、40mg制霉素，80mg头孢氨苄，10mg盐酸万古霉素、10mL吐温80和1000mL去离子水。B.2制备a)称取10g示蛋白胨（Oxoid）、0.25g无水氯化钙、0.5g酪氨酸和15g琼脂粉溶解到500mL蒸馏水;b)称取10g脱脂奶粉溶解到500mL蒸馏水；c)取10mL吐温80装入独立三角瓶中；d)上述三组成分在121。C高压蒸汽灭e)灭菌后上述三组成分在无菌条件下混合；f)将40mg制霉素、80mg头孢氨苄、10mg盐酸万古霉素分别溶解于10mL70%酒精；g)当培养基冷却至50℃左右时，在无菌条件下加入三种抗生