蛋白质与酶的应用课件

16四月2024蛋白质与酶的应用

第一节概述

一、工业用酶制剂的市场和发展历史二、工业用酶制剂的来源一、工业用酶制剂的市场和发展历史自20世纪中叶以来，工业用酶制剂的市场得到了蓬勃发展。据统计数据表明：1981年工业酶制剂生产量约65000t，产值4亿美元；1985年工业酶制剂约生产75000t，产值约6亿美元。进入20世纪90年代后，市场对酶制剂的需求增强，以世界上最大的酶制剂生产商丹麦的NovoNordisk公司为例：1993年酶制剂销售为9亿美元；1998年产业用酶的销售额为15.18亿美元。目前在世界上最有影响的酶制剂厂主要有：丹麦的NovoNordisk公司(在全世界50个国家有13000个从业人员，在140个国家销售其产品)荷兰的Gist—Brocades公司美国的Genencor公司，其产品占市场的74.3%下列的几个图表分别表示欧洲、日本酶制剂市场发展情况及酶制剂在各行业的应用现状。二、工业用酶制剂的来源1.工业用酶制剂的数量及主要种类：自然界发现的酶有数千种，但工业上常用的酶只有数十种，而目前大量生产的仅有十余种。其中80％的工业酶是水解酶，主要用于降解自然界中的高聚物，如淀粉、蛋白质、脂肪等物质。故蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是目前工业应用的3大主要酶制剂。蛋白酶可用于去污剂、奶制品业、皮革业等；淀粉酶用于烘焙、酿造、淀粉糖化和纺织业，脂肪酶用于去污剂、食品和精细化工工业等。

2.动植物来源的酶：大多数生物都是有用酶的来源，但只有有限数量的植物和动物是经济的酶源，多数酶是从微生物获得的。植物和动物来源的酶一般是食品工业的重要用酶。

植物来源的酶主要有：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、麦芽淀粉水解酶、大豆脂肪氧合酶等。

动物酶来源的酶主要有：猪胰蛋白酶和胃脂肪酶等。

3.微生物来源的酶：微生物是酶制剂的重要来源，这是因为微生物具备如下优势：①微生物繁殖速度快细菌在合适的条件下20～30min就可以繁殖一代，其生长速度为农作物的500倍，为家畜的l000倍。②微生物种类繁多，酶的品种全在不同环境下生存的微生物有不同的代谢途径，可以产生适应不同环境的酶分子，如高温酶、中温酶和低温酶，耐高盐酶，耐酸、碱酶等。③微生物培养方法简单微生物培养所用的原料大多为农副产品，来源丰富，机械化程度高，易于大批量生产。连续发酵生产可以提供经济有效的酶制剂产品。④利用微生物可以生产一些极端酶由于酶在应用过程中常出现不稳定现象，尤其在高温、强酸、强碱和高渗等极端条件下更易失活，因此限制了酶在工业上的应用。利用嗜极菌生产的极端酶可克服这一缺陷。第一个极端酶——嗜热DNA聚合酶已成功地应用于PCR技术。一些嗜极菌极端酶的应用见下表：

第二节酶在食品加工方面的应用

生物技术在食品工业中应用的代表就是酶的应用，目前已经有几十种酶成功用于食品工业。如葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等。常用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶葡萄糖氧化酶等。一、应用于食品工业的酶制剂二、酶法生产葡萄糖三、果葡糖浆的生产四、饴糖的生产五、酶在蛋白制品加工中的应用六、酶在果蔬加工中的应用七、酶在改善食品品质与风味中的应用一、应用于食品工业的酶制剂

应用于食品工业中的酶制剂归纳于下表：二、酶法生产葡萄糖现在国内外葡萄糖的生产大都采用酶法。酶法生产葡萄糖是以淀粉为原料，先经α—淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成葡萄糖。其生产步骤如下：

1.α-淀粉酶液化：

淀粉先加水配制成浓度为30～40％的淀粉浆，pH值调至6.0～6.5，加一定量的α—淀粉酶，85～90℃下保温45min左右，淀粉液化成糊精。

注意：

当采用高温淀粉酶时，液化温度可提高至106～115℃，可大大缩短淀粉液化时间，提高液化效率。为了保持α-淀粉酶的稳定性，通常要在淀粉浆中添加一定量的氯化钙和氯化钠。液化反应一般以碘反应颜色正好消失时为终点。2.糖化酶糖化：液化完成后，将液化淀粉液冷却至55～60℃，pH调至4.5～5.0，加入适量的糖化酶，保温糖化48h左右，使糊精转变为葡萄糖。3.注意：

α—淀粉酶和糖化酶都要求达到一定的纯度。尤其是糖化酶中应不含或尽量少含葡萄糖苷转移酶．因为葡萄糖苷转移酶会催化葡萄糖生成异麦芽糖等杂质，严重影响葡萄糖的收率。若糖化酶中含有葡萄糖苷转移酶，则要在使用前进行适当的处理．以除去。去除葡萄糖转苷酶的最简单的方法之一是将糖化酶配成酶液后，加酸调节pH值至2.0～2.5，室温下静置一段时间，可以选择性地破坏葡萄糖苷转移酶。葡萄糖的生产除了使用游离酶分批进行液化和糖化以外，可采用固定化糖化酶，将糊精连续水解成葡萄糖。三、果葡糖浆的生产

1.果葡糖浆：是由葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成部分果糖而得到的葡萄糖与果糖的混合糖浆。1969年日本首先用游离葡萄糖异构酶工业化生产果葡糖浆，1973年以后，国内外纷纷采用固定化匍萄糖异构酶进行连续化生产。

2.葡萄糖液的获得：果葡糖桨生产所使用的葡萄糖，一般是由淀粉经α-淀粉酶液化，再经糖化酶糖化，所得葡萄糖通过层析等方法分离纯化，制成浓度为40～45％的精制葡萄糖液。3.果葡糖浆的获得：将精制葡萄糖液调节pH为6.5～7.0，加入0.01mol/L的硫酸镁，在60～70℃的温度条件下，由葡萄糖异构酶催化生成果葡糖浆。异构化率一般为42～45％，

4.注意：①钙离子对淀粉酶有保护作用，在淀粉液化时需要添加，但它对葡萄糖异构酶却有抑制作用，所以葡萄糖溶液需用层析等方法精制，以除去其中所含的钙离子。②钴镁离子是葡萄糖异构酶的激活剂，所以葡萄糖液中需加入0.01mol／L左右的硫酸镁。而Co2+的需要量极微量，一般自来水中已含有，故不必另外添加。若水中完全没有Co2+的，则可加进微量的氯化钴。③葡萄糖异构酶的最适pH值，根据其来源不同而有所差别。一般放线菌产生的葡萄糖异构酶，其最适pH值在6.5～8.5的范围内。但在碱性范围内，葡萄糖容易分解而使糖浆的色泽加深，为此，生产时pH值一般控制在6.5～7.0。④葡萄糖转化为果糖的异构化反应是吸热反应。随着反应温度的升高，有利于果糖的生成。考虑到酶的稳定性，一般控制反应温度在60~70℃。

四、饴糖的生产1.饴糖：饴糖是我国传统的淀粉糖制品。是以大米或糯米为原料，加进大麦芽，利用麦芽中的α-淀粉酶和β—淀粉酶，将淀粉糖化而成的麦芽糖浆。其中含麦芽糖30～40％，糊精80～70％。2.饴糖的生产：除了用麦芽生产以外，也可用酶法生产。饴糖的酶法生产是将大米或糯米磨成粉浆，加入一定量的a-淀粉酶，在85～90℃反应一段时间，以碘反应颜色正好消失时为终点。液化结束后，冷却至62℃左右，加入一定量的β—淀粉酶，保温反应一段时间，使糊精生成麦芽糖。酶法生产的饴糖中，麦芽糖的含量可达60～70％。

五、酶在蛋白制品加工中的应用1.蛋白制品：蛋白质是食品中的主要营养成分之一，以蛋白质为主要成分的制品称为蛋白制品，如乳制品，蛋制品，鱼制品和肉制品等，酶在蛋白制品加工方面的应用也很广泛。2.在乳制品的加工方面的应用：使用凝乳蛋白酶制造奶酪；用乳糖酶水解乳中的乳糖，生产低乳糖奶，1977年后已可用固定化乳糖酶连续生产；用过氧化氢酶除去杀菌处理后残存在牛奶或奶酪中的过氧化氢；用蛋白酶生产乳蛋白(酪蛋白)水解物等。

3.在蛋制品加工方面的应用：用葡萄糖氧化酶除去全蛋粉、蛋黄粉或蛋白片中存在的少量葡萄糖，以防止褐变，提高产品质量。

4.在鱼制品加工方面的应用：利用蛋白酶生产可溶性的鱼蛋白粉，鱼露等；用三甲基胺氧化酶使鱼制品脱除腥味等，5.在肉制品加工方面的应用：用蛋白酶制造肉类水解蛋白；用木瓜蛋白酶制成嫩肉粉，使肉食嫩滑可口；用蛋白酶生产明胶；用溶菌酶进行肉类制品的保鲜防腐等。六、酶在果蔬加工中的应用1.果胶酶：用于果汁和果酒的澄清方面效果极佳；2.柚苷酶：用于分解柑桔类果肉和果汁中的柚皮苷，以脱除苦味；3.橙皮苷酶：可使橙皮苷分解，能有效地防止柑桔类罐头制品出现白色浑浊；4.葡萄糖氧化酶：可去除果汁、饮料、罐头食品和干燥果蔬制品中的氧气，防止产品氧化变质，防上微生物生长，以延长食品保存期；5.溶菌酶：可防止细菌污染，起食品保鲜作用等。七、酶在改善食品品质与风味中的应用

酶不仅广泛用于食品的制造与加工，而且在改善食品的品质和风味方面大有用场。风味酶的发现和应用，在食品风味的再现、强化和改变方面有广阔应用前景。例如：用洋葱风味酶处理甘蓝等蔬菜，可使被处理的蔬菜呈现出洋葱的风味；用奶油风味酶作用于含乳脂的巧克力、冰淇淋，人造奶油等食品，可使这些食品增强奶油的风味。一些食品在加工或保藏过程中，可能会使原有的风味减弱或失去，若在这些食品中添加各自特有的风味酶，则可使它们恢复甚至强化原来的天然风味。

第三节酶在轻工业方面的应用

轻工业与人们日常生活密切相关，酶在轻工业方面的广泛应用可以提高产品质量，降低原材料消耗，改善劳动条件，减轻劳动强度等，具有良好的经济效益和社会效益。

酶在轻工业方面的应用主要有3个方面：一、用酶进行原料处理二、用酶生产各种产品三、用酶增强产品的使用效果一、用酶进行原料处理

许多轻工原料在应用或加工之前都需要经过原料处理。其中有不少原料可以用酶进行处理，以缩短原料处理时间，提高处理效果，提高产品质量，改善劳动条件，减轻劳动强度。

1.发酵原料的处理：发酵工业多以淀粉为主要原料。有些微生物由于本身缺乏淀粉酶系，无法直接利用淀粉。故此必须先经过原料处理，将淀粉转化为可发酵的单糖或二糖，才能利用。例如：酒精、酒类、甘油、乳酸、氨基酸、核苷酸等发酵所使用的酵母或细菌等微生物，一般都不能直接利用淀粉进行发酵，故必需在发酵前对淀粉原料进行处理。

淀粉原料的处理：一般是采用α-淀粉酶进行液化，然后再经糖化酶进行糖化，将淀粉转变为葡萄糖。

纤维素原料处理：含纤维素的发酵原料可用纤维素酶处理，使纤维素水解为可发酵的葡萄糖。纤维素酶的研究和应用在国际上普遍受到关注，巳取得显著成果，但仍有不少问题有待研究解决．

含戊聚糖的植物原料的处理：可用各种戊聚糖酶处理，将戊聚糖水解为各种戊糖后用于发酵。2.纺织原料的处理：在纺织工业中，为了增强纤维的强度和光滑性，便于纺织，需要先上浆，然后在漂白、印染之前又需退浆。

上浆：将淀粉用α-淀粉酶处理一段时间，使粘度达到一定程度以用作上浆的浆料。

退浆：纺织品在漂白、印染之前，需将附着在其上的浆料除去，利用α-淀粉酶使浆料水解，就可使浆料退尽，这称为退浆。有些纺织品上浆时用的是动物胶作胶浆，可用蛋白酶使之退浆．3.造纸原料的制浆：造纸原料的纤维中含有大量木质素，若不除去则会严重影响纸的质量．采用碱法制浆除去木质素，易造成严重的环境污染。而用木质素酶可以使木质素水解而除去，不但可提高纸的质量，而且使环境污染程度大为减轻；

4.生丝的脱胶处理：天然蚕丝的主要成分是不溶于水的有光泽的丝蛋白。丝蛋白的表面有一层丝胶包裹着。在缫丝过程中，必须进行脱胶处理，即将表面的丝胶除去，以提高丝的质量。采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或微生物蛋白酶处理，可在比较温和的条件下催化丝胶蛋白水解，进行生丝脱胶。5.羊毛的除垢：羊毛在染色之前需经预处理，以除去羊毛表面的鳞垢。利用蛋白酶除垢，可提高羊毛的着色率，并保持羊毛的特点，提高羊毛制品的质量。二、用酶生产各种产品

利用酶的催化作用可将原料转变为所需的产品，也可利用酶的作用除去某些不需要的物质而得到所需的产品。

1.酶法生产L-氨基酸：酶法生产L-氨基酸是利用酶或固定化酶的催化作用，将各种底物转化为L-氨基酸，或将DL-氨基酸拆分而生产L-氨基酸。有多种酶可用于L-氨基酸的生产，其中有些巳采用固定化酶进行连续生产。

例如：用L-氨基酸酰化酶光学拆分DL-酰基氨基酸生成L-氨基酸。将化学合成的N-酰基-DL-氨基酸经L-氨基酸酰化酶进行不对称水解，L—酰基氨基酸被水解生成L-氨基酸，余下的N-酰基-D-氨基酸经化学消旋再生成DL-酰基氨基酸，重新进行不对称水解。反复进行，可将DL-酰基氨基酸几乎都变成L-氨基酸。工业上已用固定化L-氨基酰化酶连续生产L-苯丙氨酸和L-色氨酸。用天门冬氨酸酶将延胡索酸(反丁烯二酸)氨基化生成L-天门冬氨酸。工业上已用固定化大肠杆菌菌体的天门冬氨酸酶连续生产L-天门冬氨酸。2.酶法生产核苷酸：核苷酸在食品和医药等方面有重要用途，可利用多种酶进行生产。

例如：用桔青霉或产黄青霉产生的5’-磷酸二酯酶水解核糖核酸(RNA)，生产各种5'-核苷酸。

用腺苷酸脱氨酶水解AMP，脱氨基生成肌苷酸(IMP)。

用核苷磷酸化酶，可催化肌苷进行磷酸化生成5'-肌苷酸，催化鸟苷生成5'-鸟苷酸等。

用核苷酸磷酸化酶，催化AMP生成ADP和ATP等．

3.酶法生产有机酸：通过酶的催化作用可以生产有机酸．

例如：用延胡索酸酶生产L—苹果酸。延胡索酸通过延胡索酸酶的催化作用，生成L—苹果酸。工业上巳采用固定化黄色短杆菌或产氨短杆菌的延胡索酸酶连续生产L—苹果酸。用环氧琥珀酸水解酶催化环氧疏珀酸水解生成L—酒石酸。4.酶法制酱：在酱油或豆酱的生产中，利用蛋白酶催化大豆蛋白质水解，可以大大缩短生产周期，提高蛋白质的利用率．用蛋白酶还可以生产出优质低盐酱油或无盐酱油。此外，在酱油酿造过程中，添加一些纤维素酶等可以提高原料利用率。

5.酶法制革：在制革工业中，利用蛋白酶使原料皮脱毛，可以提高皮革产品质量，改善劳动环境。采用酸性蛋白酶和少量脂肪酶进行皮革软化，可以很好地除去污垢，使皮质松软透气，提高皮革质量。在某些轻工产品中添加一定量的酶，可显著增强使用效果。

1.加酶洗涤剂：在洗涤剂中添加适当的酶可以大大缩短洗涤时间，提高洗涤效果。根据洗涤对象的不同，添加的酶有所差异。其中最广泛使用的是碱性蛋白酶。目前全世界所生产的酶之中，总产量的三分之一左右是碱性蛋白酶．碱性蛋白酶的大部分用于加酶洗涤剂。蛋白酶的添加量一般为洗涤剂的0.1～1％。为了使酶与固体洗涤剂能够混合均匀，可将酶制剂加工成一定形状，一定相对密度的颗粒，已有多种型号的造粒机可供选择使用。酶也可以加到肥皂中制成加酶肥皂等。除了碱性蛋白酶之外，固体和液体洗涤剂中还可视需要添加淀粉酶、脂肪酶、果胶酶和纤维素酶等。

三、用酶增强产品的使用效果2.加酶牙膏、牙粉和嗽口水：

将适当的酶添加到牙膏、牙粉或嗽口水巾，可以利用酶的催化作用，增加洁齿效果，减少牙垢并可防止龋齿的发生。可添加到洁齿用品中的酶有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和右旋糖酐酶等．其中右旋糖酐酶对预防龋齿有显著功效。3.加酶饲料：

在家禽、家畜的饲料中添加淀粉酶、蛋白酶，纤维素酶和半纤维素酶等，可以增加饲料的可消化性，促进家禽家畜的生长，增加家禽的产卵率等。

4.加酶护肤用品：

在各种护肤品及化妆品中添加超氧物歧化酶(SOD)，碱性磷酸酶，尿酸酶、弹性蛋白酶等，可有效地提高护肤效果。

第四节酶在医学中的应用酶在医药领域的用途很广，随着酶分子修饰和酶固定化等酶技术的发展，将不断扩大酶在医药方面的应用。一、主要的医药用酶二、用酶进行疾病的诊断三、用酶治疗各种疾病

四、用酶制造各种药物

一、主要的医药用酶

巳在医药方面应用的酶不少（见下表）。由于酶具有专一性和高效率的特点，所以在医药方面使用的酶具有种类多、用量少、纯度高的特点。二、用酶进行疾病的诊断酶学诊断方法是可靠、简便又快捷的诊断方法。酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。

1．根据体液内酶活力的变化诊断疾病一般健康人体液内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的，若出现某些疾病，则体液内的某种或某些酶的活力将会发生相应的变化。故此，可以根据体液内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。（见下表）

2．用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量，从而诊断某些疾病。

例如：利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的联合作用，检测血液或尿液中葡萄糖的含量，从而作为糖尿病临床诊断的依据，这两种酶都可以固定化后制成酶试纸或酶电极，从而十分方便地用于临床检测。利用尿酸酶测定血液中尿酸的含量，从而诊断痛风病。固定化尿酸酶巳在临床诊断中使用。利用胆碱酯酶或胆固醇氧化酶测定血液中胆固醇的含量，从而诊断心血管疾病和高血压等．这两种酶都经固定化制成酶电极使用。

酶标免疫测定：先把酶与某种抗体或抗原结合，制成酶标记的抗体或抗原．然后利用酶标抗体(或酶标抗原)与待测定的抗原(或抗体)结合，再借助于酶的催化特性进行定量测定，测出酶—抗体—抗原结合物中的酶的含量，就可计算出欲测定的抗体或抗原的含量。通过抗体或抗原的量就可诊断某种疾病。常用的标记酶有碱性磷酸酶和过氧化物酶等。通过酶标免疫测定，可以诊断肠虫、毛线虫、血吸虫等寄生虫病以及疟疾、麻疹、疱疹、乙型肝炎等疾病。随着细胞工程的发展，巳生产出各种单克隆抗体，为酶标免疫测定带来极大的方便和广阔的应用前景。三、用酶治疗各种疾病酶作为药物可以治疗多种疾病。而且具有疗效显著，副作用小的特点。应用日益广泛。

1．蛋白酶：蛋白酶可用于治疗多种疾病，是在临床上使用最早，最广的药用酶之一。

蛋白酶可作为消化剂，用于治疗消化不良和食欲不振。使用时往往与淀粉酶，脂肪酶等制成复合制剂，以增加疗效。作为消化剂使用时，蛋白酶一般制成片剂，以口服方式给药．蛋白酶可作为消炎剂，治疗各种炎症有很好的疗效。蛋白酶之所以有消炎作用，是由于它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出井抑制肉芽的形成。给药方式可以口服、局部外敷或肌肉注射等。

蛋白酶经静脉注射，可治疗高血压。这是由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原水解部分肽段而生成运动迟缓素和胰血管舒张素，使血压下降。蛋白酶注射入人体后，可能引起抗原反应。通过酶分子修饰技术，可使抗原性降低或消除。另外，蛋白酶在使用时还可能产生某些局部过敏反应，要引起注意。目前临床上使用的蛋白酶大部分来自动物和植物酶，胃蛋白酶和菠萝蛋白酶等．2．溶菌酶溶苗酶也是一种应用广泛的药用酶，具有抗菌、消炎、镇痛等作用．

溶菌酶作用于细菌的细胞壁，可使病原菌，腐败性细菌等溶解死灭，对抗生素有耐药性的细菌同样起溶菌作用，具有显著疗效而对人体的副作用很小，是一种较为理想的药用酶，溶菌酶与抗生素联合使用，可显著提高抗生素的疗效。四、用酶制造各种药物

酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。

例如：用青霉素酰化酶合成各种新型的β—内酰胺抗生素，包括青霉素和头孢霉素；用β—酪氨酸酶生产多巴(DOPA)；用蛋白酶生产各种氨基酸和蛋白质水解液；用核糖核酸酶生产核苷酸类物质；用核苷磷酸化酶生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷(阿糖腺苷)；用多核苷酸磷酸化酶生产聚肌苷酸·聚胞苷酸(聚肌胞)；用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素。

第五节酶在分析检测方面的应用

利用酶催化作用的高度专一性对物质进行检测，巳成为物质分析检测的重要手段。一、概述二、单酶反应检测三、多酶偶联反应检测四、酶标记免疫反应检测

一、概述1.酶法检测：用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测是以酶的专一性为基础．以酶作用后物质的变化为依据来进行的。2.酶法检测的基本条件：要进行酶法检测必须具备两个基本条件：一是要有专一性高的酶，二是对酶作用后的物质变化要有可靠的检出方法．3.酶法检测步骤：酶法检测一般包括两个步骤，第一步是酶反应。即将酶与样品接触，在适宜的条件下(包括温度，pH值、抑制剂和激活剂浓度等)进行催化反应。第二步是检测。即测定反应前后物质的变化情况，可以测定底物的减少，产物的增加或辅酶的变化等。4.检测方法：

可采用化学检测法，光学检测法，气体检测法等。特别是当前迅速发展并广泛应用的各种酶传感器，将反应与检测两个步骤密切结合起来，具有快速、方便、灵敏、精确的特点，在酶法检测中发挥了巨大的作用，且更进一步推动了酶法检测的发展。

5.酶法检测的种类：可用酶法检测的物质很多，可用于酶法检测的酶和检测手段也不少。根据酶反应的不同，把酶法检测分成单酶反应，多酶偶联反应和酶标免疫反应等3类。

二、单酶反应检测

利用单一种酶与底物反应，然后用各种方法测出反应前后物质的变化，从而确定底物的量。这是最简单的酶法检测技术。使用的酶可以是游离酶，也可以是固定化酶或单酶电极等。

1．L—谷氨酸脱羧酶L-谷氨酸脱羧酶专一地催化L-谷氨酸脱羧生成Y—氨基丁酸和二氧化碳，生成的二氧化碳可以用气体检测法测定。该酶巳广泛地用于L—谷氨酸的定量分析。可使用游离酶、固定化酶或酶电极。检测二氧化碳可以用华勃氏呼吸仪或二氧化碳电极等。

2.脲酶脲酶能专一地催化尿素水解生成氨和二氧化碳。通过气体检测或者使用氨电极、二氧化碳电极、NH4+电极等，测出氨或二氧化碳的量，就可确定尿素的量。3．葡萄糖氧化酶该酶催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和双氧水。

可通过测定酸的生成或氧的减少来确定葡萄糖的量，也可用PH电极、氧电极等测出葡萄糖的量。该酶巳广泛用于食品，发酵工业和临床诊断等方面。三、多酶偶联反应检测

多酶偶联反应检测是利用两种或两种以上的酶的联合作用，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定被测物质的量。多酶偶联反应检测可克服单酶检测易出现的其他物质干扰，或检测的灵敏度不高等缺点，使酶法检测易于进行并达到较理想的结果。1．葡萄糖氧化酶与过氧化物酶偶联通过这两种酶的联合作用以检测葡萄糖的含量。使用时先将葡萄糖氧化酶，过氧化物酶与还原型邻联甲苯胺一起用明胶共固定在滤纸条上制成酶试纸。测试时将酶试纸与样品溶液接触，在10～60s的时间内试纸即显色。从颜色的深浅判定样品液中葡萄糖的含量。

其原理是：葡萄糖氧化酶催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和双氧水，生成的双氧水在过氧化物酶的作用下分解为水和原子氧，新生态的原子氧将无色的还原型邻联苯甲胺氧化成蓝色物质。颜色的深浅与样品中葡萄糖浓度成正比。随着样品中葡萄糖浓度的增加，酶试纸的颜色由粉红一紫红一紫色一蓝色，不断加深。其反应过程如下：

此酶试纸已在临床中用以测定血液或尿液中的葡萄糖含量，以诊断糖尿病。四、酶标记免疫反应检测

用于测定样品液中抗体或抗原含量的技术。简称为酶标免疫检测。酶标记免疫反应检测：先将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。若要测定样品中抗原含量，就将酶与欲测定抗原的对应抗体结合，制成酶标抗体，反之，若要测定抗体，则需先制成酶标抗原。然后将酶标抗体(或酶标抗原)与样品液中待测抗原(或抗体)，通过免疫反应结合在一起，形成酶—抗体—抗原复合物，通过测定复合物中酶的含量就可得出欲测抗原或抗体的量。常用于酶标免疫测定的酶有碱性磷酸酶和过氧化氢酶等。碱性磷酸酶将碱性磷酸酶与抗体(或抗原)结合，制成碱性磷酸酶标记抗体(或碱性磷酸酶标记抗原)。该酶标记抗体(或酶标抗原)与样品液中的对应抗原(或抗体)，通过免疫反应结合成碱性磷酸酶—抗体—抗原复合物。将该复合物与硝基酚磷酸(NPP)反应。碱性磷酸酶催化NPP水解生成硝基酚和磷酸。硝基酚呈黄色，黄色的深浅与碱性磷酸酶的含量呈正比。故此．通过分光光度计测定420nm波长下的光吸收率(A420)，就可测出复合物中碱性磷酸酶的量，从而计算出欲测抗原(或抗体)的含量。酶标免疫测定技术还可以应用于某些具有亲和力的生物分子对之间的测定。如用酶标抗胰岛素蛋白测定胰岛素的含量，酶标抗生物素蛋白测定生物素含量等。这类检测的原理与酶标免疫测定相类似，但由于不是抗体抗原间的免疫结合，只是分子对之间的亲和结合，故称为酶标亲和检测。

第六节酶在生物工程中的应用

生物工程主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个方面。酶在生物工程中有着极为重要的作用，尤其在基因工程及细胞工程中，酶的应用主要在以下几个方面：一、酶在除去细胞壁方面的应用二、酶在大分子切割方面的应用三、酶在大分子拚接方面的应用一、酶在除去细胞壁方面的应用根据不同细胞的结构和细胞壁的组分不同，除去细胞壁所使用的酶也各异。1．除去细菌细胞壁细菌的细胞壁主要成分是肽多糖。革兰氏阴性菌的细胞壁除了肽多糖以外，还有一层脂多糖。

除去革兰氏阳性菌的细胞壁：采用从蛋清中分离得到的溶菌酶。该酶专一地作用于细菌细胞壁的肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的a-1，4键。

除去革兰氏阴性菌的细胞壁：需由溶菌酶和EDTA共同作用才能达到较好的除去细胞壁的效果。这是由于EDTA可作用于脂多糖的缘故。

2．除去酵母细胞壁酵母的细胞壁分为两层，外层由磷酸甘露糖和蛋白质组成，内层由β—葡聚糖构成细胞壁的骨架。

除去酵母细胞壁：主要采用β-1，3-葡聚糖酶。该酶作用于细胞壁内层的β-葡聚糖分子中β-1，3-糖苷键，使作为细胞壁骨架的β-葡聚糖水解，而使细胞壁破坏。蜗牛的消化液中含有较多的β-1，3-葡聚糖酶，故常用于酵母的破壁。若β-葡聚糖酶与磷酸甘露糖酶及蛋白酶联合作用，则可使细胞壁的内外两层同时被破坏，而显著提高破壁效果。

3．除去霉菌细胞壁霉菌的细胞壁结构比较复杂。不同种属的霉菌。其细胞壁结构和组分有较大差别。因此，若要除去霉菌的细胞壁，需要弄清属于什么霉菌，再选用适宜的几种酶共同作用，才能达到较好的破壁效果。

毛霉，根霉等藻菌纲霉菌的细胞壁主要由几丁质(N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4-键结合而成)和壳多糖(氨基葡萄糖以β-1，4-键结合而成)等多种物质组成。破壁时主要采用放线菌或细菌产生的壳多糖酶、几丁质酶及蛋白酶等多种酶的混合物。这些混合多酶制剂一般称之为细胞壁溶解酶(LyticEnzym)．

米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌纲霉菌的细胞壁的主要组分是几丁质和6-葡聚糖等。破壁时主要使用β–1，3-葡聚糖酶和几丁质酶的混合物。4．植物细胞壁的破除植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等组成。

破除植物细胞壁主要采用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成的混合酶。这几种酶大多数是由霉菌发酵产生。利用酶除去细胞壁，除了要根据细胞的结构特点选用适宜的酶之外，还必须控制好酶作用条件和时间。此外，若用酶除去细胞壁以制备原生质体时，必须在反应系统中添加渗透压稳定剂，维持高渗状态而使制备得到的原生质体不至破裂。二、酶在大分子切割方面的应用生物工程中经常需要把生物大分子切割成较小的分子成片断，以便使用。在生物大分子的切割过程中往往要求在特定的位点上进行，这就只能借助于具有专一性的各种水解酶或其他酶类才能做到。下面仅介绍在基因工程方面常用的几种水解酶。

1．限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶：是一类在特定的位点上，催化双链DNA水解的磷酸二酯酶。是在1968年由Meselson和Yuan在大肠杆菌细胞中首次发现的。至今为止巳发现的核酸内切酶有300多种，巳成为基因工程中必不可缺的常用工具酶。

限制性核酸内切酶具有高度的专一性：它能够识别双链DNA中的某段碱基的排列顺序，并且只能在某个特定位点上将DNA分子切开。

限制性核酸内切酶的碱基识别顺序：一般由4～6个核苷酸组成。这个识别顺序呈二元对称结构，即从二条链的5’末端向3’末端阅读时，这个识别顺序完全相同。

限制性核酸内切酶的切割位点：一般在识别顺序内，而有的也在识别顺序之外，甚至有的切点远离碱基识别顺序几百个碱基对以外。在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其切割位点一般都在其识别顺序之内。

限制性核酸内切酶切割DNA分子：在切割DNA分子时，有些酶在两条链上的切点是错开的，切割后形成粘性末端；有些酶在两条链上的切点是平整的，切割后形成平整末端。

例如：

限制性核酸内切酶在基因工程的应用：主要用以从双链DNA分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒DNA或噬菌体DNA切开，以便进行DNA的体外重组。在应用时可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。一些常见的限制性核酸内切酶的名称和作用位点如下表2．DNA外切核酸酶

DNA外切核酸酶：从脱氧核糖核酸(DNA)分子末端开始逐个除去末端核苷酸的酶。其可以从DNA链的5’末端开始切割，也可以从3’末端开始切割，还可同时从5’末端和3’末端开始切割。其作用方式见下图。

DNA外切核酸酶在基因工程的应用：主要用于载体或基因片段的切割加工。

当获得的基因载体或基因片段太大时，可利用DNA外切酶从两条链的末端各除去若干个核苷酸，而使DNA片段缩小，以满足使用的需要；当获得的DNA片段为平整末端时，可以采用从5’末端或3’末端作用的DNA外切酶，以获得所需的带有粘性末端的DNA片段，以利于体外重组DNA。利用该酶还可从DNA生产脱氧核苷酸。3．碱性磷酸酶碱性磷酸酶可以除去DNA或RNA链中的5’磷酸。在基因工程中主要用在为防止质粒DNA的自我环化而除去5'-磷酸或在用32p对DNA或RNA进行5’末端标记之前除去5’—磷酸。

碱性磷酸酶还可以用于水解核苷酸生成核苷，并在酶标免疫测定方面应用。

4．核酸酶S1该酶作用于单链DNA或RNA。在基因工程中，用于从具有单链末端的DNA分子中除去单链部分的核苷酸，而变成平整末端的双链DNA。在以mRNA为模扳，合成互补DNA(cDNA)时，往往会生成“发夹状”环，用核酸酶s1就可使这些“发夹状环”除去。三、酶在分子拼接方面的应用

许多酶都具有分子拼接能力，能将两个或多个分子连接在一起而合成较大的分子。这些酶类在生物体内是至关重要的，它们催化各种各样的生物合成反应。但目前将这些酶提取分离出来加以应用的却不多。然而在生物工程方面，已有成功应用的例子。下面主要介绍在基因工程方面的应用。1．DNA连接酶DNA连接酶是1967年发现的能使双链DNA的缺口封闭的酶。它催化DNA片段的5’—磷酸基与另一DNA片段的3’-OH生成磷酸二酯键。

在基因工程中，主要采用的是T4-DNA连接酶，该酶是由T4—噬菌体感染大肠杆菌细胞后产生的，可用于具粘性末端的两个DNA片段的连接，也可用于有平整末端的两个DNA片段的连接。故此可将由同一种限制性核酸内切酶切出的载体DNA和目的基因连接起来，成为重组DNA。