蛋白质的研究方法与原理课件

第十章蛋白质的研究方法与原理1可编辑课件PPT第一节概述2可编辑课件PPT

蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;

（盐析法或有机溶剂法）3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；4.蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。直接从生物组织中提纯蛋白——3可编辑课件PPT

制备过程中注意事项：要求自始至终保持在天然状态避免一切过激因素--如过酸或过碱，高温，重金属等的影响。2.通常都在低温条件下操作。3.尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高水平。4可编辑课件PPT第二节蛋白质的分离与纯化技术5可编辑课件PPT一、蛋白质沉淀与结晶6可编辑课件PPT

（一）盐析法

概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。

优点：操作简便对易变性的蛋白质有一定的保护作用，适用范围十分广泛。缺点：分辨能力差，纯化倍数低7可编辑课件PPT（1）盐的种类对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力也愈强:

PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞

AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CNS-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。8可编辑课件PPT硫酸铵（常用盐析剂）

优点：盐析能力较强具有较高的溶解度较低的溶解度温度系数价格低廉不产生副作用。

缺点：缓冲能力较差

PH难控制9可编辑课件PPT（2）PH和温度S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度

除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响:PH=PI时，S。的数值极小

S。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。10可编辑课件PPT（3）蛋白质浓度

[Pr]较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开始析出，盐析界限比较宽。

[Pr]较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析界限变窄。11可编辑课件PPT1.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也促使Pr变得不稳定而聚集析出.常用的有机溶剂：乙醇和丙酮

（二）有机溶剂沉淀法

分辨力比盐析方法高，提纯效果好

12可编辑课件PPT（三）选择性沉淀法

选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标蛋白质的分离方法。例如，将提取液加热至一定温度并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。13可编辑课件PPT（四）蛋白质结晶

蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液达到过饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上，长成适合于X线衍射分析的晶体。14可编辑课件PPT二、离心技术分离蛋白质

离心技术是利用物体告诉旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其它颗粒分离之目的。15可编辑课件PPT三、层析技术分离纯化蛋白质最基本的特征：固定相流动相层析技术（chromatography）又称色谱技术，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。

各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时，这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最大的分离效果。16可编辑课件PPT

气相层析按两相状态来分液相层析

吸附层析

分配层析离子交换层析按层析机理来分

凝胶排阻层析

亲和层析

柱层析按操作方式来分薄层层析

纸层析层析技术的种类17可编辑课件PPT

（一）凝胶过滤层析又称分子筛或凝胶过滤（gelfiltration）原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。18可编辑课件PPT19可编辑课件PPT

离子交换层析法*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的

阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。20可编辑课件PPT21可编辑课件PPT

亲和层析法原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一分子可逆结合的特性。

如，酶的活性部位能和底物\抑制剂\辅助因子专一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.[酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结合蛋白与结合物之间]。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。22可编辑课件PPT

高效液相层析法（HighPerformanceLiquidChromatography

，HPLC）

又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

23可编辑课件PPT四、电泳技术分离蛋白质电泳（electrophoresis）是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。24可编辑课件PPT

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS–(十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂(Sodiumdodecylsulfate,SDS)Qu=

（迁移率）6πrηu与Q、r有关

若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS中进行电泳，由于分子筛效应，

u仅取决于分子的大小。因此SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。

25可编辑课件PPT26可编辑课件PPT

这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：

5％胶浓度时，适用于分子量6～200万的区间；

10％胶浓度时，适用于分子量1.6～7万的区间；

15％胶浓度时，适用于分子量1.2～4.5万的区间。

27可编辑课件PPT聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱28可编辑课件PPT

等电聚焦电泳——（isoelectricfocusing,IEF）

是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度。

pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。

凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等

29可编辑课件PPT

Pr分子有一定的PI，它处在一个由阳极到阴极梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。30可编辑课件PPT优点：1.有很高的分辨率；2.可以区分等电点只有0.01pH单位差异的蛋白质；3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。31可编辑课件PPT双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳--PI第二向采用SDS一凝胶电泳--分子量由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。是蛋白质组学研究的核心技术。32可编辑课件PPT双向PAGE33可编辑课件PPT具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：①等电点（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白质；②分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDa的蛋白质就比实际的少了，而大于150kDa的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；③疏水性蛋白质。

双向电泳技术缺点34可编辑课件PPT高效毛细管电泳35可编辑课件PPT1.毛细管区带电泳（CZE）

毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳,这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度依赖物质的荷/质比差异。荷/质比越大，泳动越快。36可编辑课件PPT2.毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）

将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。37可编辑课件PPT3.胶束电动毛细管色谱（Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC）

缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。

在电场力的作用下，胶束在柱中移动。38可编辑课件PPT4.毛细管等电聚焦电泳（Capillaryisoelectricfocusing，CIEF）

是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；CIEF是在毛细管内充有两性电解质，当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；此法可用于测定蛋白质的等电点、纯度鉴定、不同变异体的分析等。39可编辑课件PPT5.毛细管等速电泳（Capillaryisotachophoresis，CITP）

将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。40可编辑课件PPT6.亲和毛细管电泳（affinitycapillaryelectrophoresis,ACE）

是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。41可编辑课件PPT7.毛细管电动色谱（Capillaryelectrokineticchromatography，CEC）

在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。42可编辑课件PPT第三节蛋白质含量的测定方法43可编辑课件PPT测定蛋白质含量的方法较多基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的。44可编辑课件PPT

目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法(Biuret法)，Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。45可编辑课件PPT一、凯氏定氮法

凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为16%，通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。基本操作过程：①用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被还原成NH3

，并形成(NH4)2SO4

；②加入强碱，使硫酸铵释放出NH3，并将NH3收集在无机酸液中；③用标准碱溶液滴定，确定NH3量；④根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。46可编辑课件PPT(1)H2NCH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(2)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(3)(NH4)SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3此法灵敏度低,适用于0.3-3.0µg氮,误差为2%,最大缺点是受样品中非蛋白质含氮化合物的影响。测定前需用蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。47可编辑课件PPT优点凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。

1、酒精灯2、蒸汽发生器3、长玻璃管4、橡皮管5、小玻杯6、棒状玻璃塞7、反应室8、反应室外壳9、夹子10、反应室中插管11、冷凝管12、锥形瓶13、石棉网48可编辑课件PPT二、紫外吸收法

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系符合朗伯-比耳定律，因此，可用比色法直接测定蛋白质浓度。49可编辑课件PPT

在测定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白质的浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×A280nm―0.74×A260nm

上式中的OD280nm是蛋白质溶液在280nm下测得的光密度，OD260nm是蛋白质溶液在260nm下测得的光密度。50可编辑课件PPT优点：1.快速；2.对蛋白质无破坏性。缺点：1.不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）2.核酸可引起强烈干扰。

51可编辑课件PPT（一）考马斯亮蓝法（Bradford法）

考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，在465nm下有最大吸收峰；当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是当蛋白质含量在0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。52可编辑课件PPT

优点是：

（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。据估计比Lowry法约高四倍。（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。53可编辑课件PPT（二）lowry法

在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物

Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的Tyr和Phe残基还原，产生深兰色的钼兰和钨兰的混合物。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在680nm处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。54可编辑课件PPT优点：操作简单、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，灵敏度比较高。缺点：Folin-酚试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中的酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法受蛋白质特异性影响，蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得显色强度也不同，标准曲线也不是严格的直线。此方法的初步显色是双缩脲反应，因此，凡是干扰双缩脲反应的基团（因素）都会干扰Folin-酚反应。55可编辑课件PPT第四节蛋白质结构分析方法56可编辑课件PPT一、蛋白质的一级结构分析步骤：①分离蛋白质样品必需纯（>97%以上）。②测定蛋白质分子中多肽链的数目。

③巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，产生单一多肽链。

④分离纯化单一多肽链。⑤测定多肽链的氨基酸组成。⑥多肽链断裂可采用特异的酶或化学试剂将多肽样品断裂成肽碎片，并将其分离开来。⑦对每一肽段进行测序。⑧确定肽段在多肽链中的次序。⑨确定蛋白质分子中二硫键及酰胺基的位置以及磷酸化、糖基化位点。57可编辑课件PPT（一）测序前的准备工作1.多肽链氨基端和羧基端分析2.多肽链氨基酸组成分析3.多肽链有限水解为若干个肽段N-端：丹酰氯—丹酰肽层析分离鉴定C-端：肼解法，羧肽酶法高效液相色谱测定氨基酸的种类和含量采用特异性的酶或化学试剂将单一多肽链有限水解为具有部分重叠的若干个肽段。58可编辑课件PPT（二）多肽链氨基酸序列测定1.Edman降解法Edman降解法：是肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔·埃德曼（PehrEdman）首先创立。59可编辑课件PPT

原理：用异硫氰酸苯酯（PITC）与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸处理，关环，肽链N-端被选择性地切断，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。60可编辑课件PPT

优点：

能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，缺点：由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为–SO3H，然后才能用Edman降解测定序列。61可编辑课件PPT2.质谱法质谱技术－－基于串联质谱技术的氨基酸测序方法是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特点而设计的。①先测定某一肽段（如：A-B-C-D-E-F-G--）以及从C-末端或N-末端去除一个残基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子质量，二者之差值即为末端残基（A）的分子质量。②然后与20种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。测定时：62可编辑课件PPT

实际操作时：从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从N一末端或C一末端开始）。63可编辑课件PPT二、蛋白质空间结构分析（一）X射线衍射晶体分析法（二）核磁共振法（三）圆二色谱法（四）傅里叶变换红外光谱法（五）生物信息学预测蛋白质空间结构64可编辑课件PPT（一）X射线衍射晶体分析法65可编辑课件PPTX射线本质

X射线是一种短波长(0.005～10nm)、高能量(2.5×105

～1.2×102eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。66可编辑课件PPTX-射线晶体结构分析基本原理

X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象

X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。

67可编辑课件PPT（二）核磁共振法1946年美国斯坦福大学的F.Bloch和哈佛大学的E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。1983年，瑞士科学家KurtWüthrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象.发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖

68可编辑课件PPT

NMR基本原理核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4

600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。

核磁共振波谱仪69可编辑课件PPT核磁共振法中几个常用的参数化学位移耦合常数NOE（核欧沃豪斯效应）信号强度谱峰面积弛豫时间70可编辑课件PPT（1）化学位移

δ值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；δ值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。71可编辑课件PPT（2）耦合常数核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋－自旋耦合常数,用J表示。耦合常数用来表征两核之间耦合作用的大小。J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关。72可编辑课件PPT

（3）NOE信号强度

当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应（NOE）。73可编辑课件PPT（4）谱峰面积谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。74可编辑课件PPT（5）弛豫时间原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。自旋晶格弛豫：处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。

自旋-自旋弛豫：两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。

75可编辑课件PPT

二维核磁共振(2DNMR）NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图。1H-1HCOSY、

1H-15NHSQC76可编辑课件PPT核磁共振技术的应用早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等。后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面77可编辑课件PPT（三）圆二色谱法圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。1969年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。78可编辑课件PPT平面偏振光：指振动方向在同一平面内的电磁波。圆偏振光：当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差1/4波长(90°)时，其合成矢量绕光传播方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量E末端轨迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电场矢量方向顺时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋转的则称左圆偏振光。椭圆偏振光：振幅不等的左、右圆偏振光合成79可编辑课件PPT圆二色性和圆二色谱圆二色性：当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示圆二色谱：指椭圆度(或比椭圆度等)与波长的关系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。80可编辑课件PPT圆二色谱的应用在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定生物大分子的空间结构。生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构。81可编辑课件PPT蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。肽键的不对称性使得它总有光活性82可编辑课件PPT蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围:1）250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n→π*电子跃迁引起；远紫外CD主要应用于蛋白质二级结构的解析

2）250～300nm的近紫外光谱区，主要由侧链芳香基团的π→π*电子跃迁引起；近紫外CD主要揭示蛋白质的三级结构信息

3）300～700nm的紫外-可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。紫外-可见光CD主要用于辅基的偶合分析。

83可编辑课件PPT肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。84可编辑课件PPT

α-螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；β-折叠的CD光谱在216nm有一负谱带，在185～200nm有一正谱带；β-转角在206nm附近有一正CD谱带，而左手螺旋P2结构在相应的位置有负的CD谱带，如上图和表所示。

-band(nm)+band(nm)α-螺旋222，208192β-折叠216195β-转角220-230(弱)，180-190（强）205左手螺旋P2结构190210-230（弱）无规则卷曲20021285可编辑课件PPT86可编辑课件PPT

CD数据拟合计算蛋白质的二级结构的方法基本原理是假设蛋白质在波长λ处的CD信号θ(λ)是蛋白质中或多肽各种二级结构组分及由芳香基团引起的噪音的线性加，θ(λ)=Σfiθ(λ)i+noise。θ(λ)i是第i个二级结构成分的CD信号值，fi为第i个二级结构成分的含量分数，Σfi规定值为1；通过已知蛋白（或称参考蛋白）二级结构的圆二色数据库，曲线拟合未知蛋白或多肽的圆二色数据，估算未知蛋白或多肽的二级结构。87可编辑课件PPT

蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方法中，主要采用多聚氨基酸为参考多肽。Greenfield等采用多聚L-lys作参考多肽，建立α-螺旋、β-折叠及无规卷曲等二级结构参考CD光谱曲线，采用单一波长法（208nm）计算出α-螺旋含量后，然后假设不同的β-折叠含量（Xβ）值，并假设CD值是α-螺旋含量(XH)、β-折叠含量(Xβ)无规卷曲(XR)三者贡献值的加和，即：

XH+Xβ+XR=1

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通过计算得到不同波长的θ(λ)，得出计算曲线。假设一些不同的Xβ值，分别求出它们相应的计算曲线，找出与实验曲线最接近的曲线，相应于该最接近曲线的Xβ及XR即认为是该蛋白质的相应结构含量。89可编辑课件PPTExamplefit:myoglobin(肌红蛋白)Inthiscase:qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith xa=80%, xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coil90可编辑课件PPT（四）傅里叶变换红外光谱法傅里叶变换红外光谱法(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIS)主要是对其红外光谱中酰胺I谱带进行分析。酰胺I谱带为α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等不同结构振动峰的加和带，彼此重叠，在1260~1700cm-1范围内通常为一个不易分辨的宽谱带。目前常应用去卷积、微分等数学方法，使加合带中处于不同波数的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等各个吸收峰得以分辨。最后经谱带拟合，获得各个吸收峰的信息。91可编辑课件PPT（五）生物信息学预测蛋白质空间结构1.同源模建法是预测蛋白质三维结构的主要方法，通过对蛋白质数据库分析可以得到结论：任何两种蛋白质，如果两者的序列同源部分超过30%，则它们具有相似的三维结构，及他们的基本折叠相同，只是在非螺旋和非折叠区域的一些细节部分有所不同。蛋白质的结构比蛋白质的序列更保守，如果两个蛋白质的氨基酸序列有50%相同，那么约有90%的α碳原子的位置偏差不超过3%。92可编辑课件PPT主要步骤：①识别模拟的模板；②目标序列和模板序列的排列；③构建模型；④构建非保守的loop区；⑤安装侧链；⑥模型修饰；⑦结构合理性评估93可编辑课件PPT2.折叠识别法也称穿线法（threading）。通过对已知的蛋白质结构的研究发现，大量序列同源性较差的蛋白质存在相同的折叠结构。折叠识别法就是利用已知蛋白质的折叠子为模板，寻找给定氨基酸序列可能采取的折叠类型，进而进行结构预测。94可编辑课件PPT主要步骤：①建立模板数据库；②构造打分函数；③比对；④预测95可编辑课件PPT3.从头预测法

蛋白质结构从头预测是不依赖模板仅从氨基酸序列信息得到天然结构。它的关键是正确定义能量函数、精确选用计算机搜索算法来寻找能量最低值。96可编辑课件PPT第五节蛋白质功能分析方法97可编辑课件PPT一、酵母双杂交技术利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探测蛋白质-蛋白质的相互作用。

98可编辑课件PPT99可编辑课件PPT

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含Transcription-activatingdomain的载体。1）两种蛋白之间是否有相互作用2）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白应用

100可编辑课件PPT二、噬菌体展示技术101可编辑课件PPT102可编辑课件PPT三、表面等离子共振技术103可编辑课件PPT四、蛋白质芯片技术104可编辑课件PPT生物芯片基因芯片蛋白质芯片微流控芯片蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。

105可编辑课件PPT106可编辑课件PPT（一）蛋白质芯片的分类1.根据应用分类:

①蛋白检测芯片

将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用于识别复杂生物样品中的目标蛋白/多肽。根据检测方法,不同蛋白质检测芯片又可进一步分为正相蛋白质检测芯片和反相蛋白质检测芯片。②蛋白功能芯片天然蛋白点加在基片上，了解体系中哪种蛋白能与已知的某种蛋白结合，用于天然蛋白活性及分子亲和性研究。107可编辑课件PPT2.根据载体分类：普通玻璃载体芯片、微孔型芯片、多孔凝胶覆盖芯片3.由CiphergenBiosystems提出的化学型蛋白质芯片和生物型蛋白质芯片。108可编辑课件PPT蛋白质芯片的应用临床检验及环境毒物检测所需的免疫检测和酶活性分析高通量抗体筛选蛋白质组学研究生物大分子间的相互作用蛋白质和小分子间的相互作用药物靶标及其作用机理的研究疾病诊断食品中有毒有害物质的分析、在毒理学及卫生检验中的应用109可编辑课件PPT五、免疫印迹技术免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Westernblotting），是检测蛋白质混合物中某种特定蛋白质的定性方法，也可以用于确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞不同条件下相对含量的半定量方法。免疫印迹也是利用抗原抗体特异反应的原理。免疫印迹技术（Westernblotting)分三个阶段进行。110可编辑课件PPT第一阶段：十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS)第二阶段：电转移，将在凝胶中已经分离的