纸层析法分析氨基酸专家讲座

试验二、纸层析法分析氨基酸一、试验目标1.掌握纸上层析普通原理和操作方法。2.了解氨基酸特征性颜色反应。3.学会分析未知样品氨基酸成份。纸层析法分析氨基酸专家讲座第1页

纸上层析法是分配层析法中一个，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、判定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质一项主要而简便分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中主要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。

二、试验原理纸层析法分析氨基酸专家讲座第2页

常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后水相,一个是饱和了水后有机溶剂相。因为滤纸纤维素上羟基和水分子有较大亲和力,其吸附水相为固定相,有机溶剂相为移动相。因为物质极性大小不一样,在两相中分配百分比有所差异。极性小物质在有机相中分配较多,随有机相移动较快；而极性大物质在水相中分配较多,移动相对较慢,从而将极性不一样物质分开纸上层析原理纸层析法分析氨基酸专家讲座第3页

在相同条件下，每种物质都有其固定Rf值。

Rf值定义为：原点到层析斑点中心距离

Rf=

原点到溶剂前沿距离纸层析法分析氨基酸专家讲座第4页影响Rf值原因有：

①物质本身化学结构；②展层所用溶剂系统；③展层剂pH值；④展层时温度；⑤展层所用滤纸；⑥展层方向(横向，上行或下行)。用纸层析判定样品时，普通都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文件记载该物质层析条件，依据文件Rf值进行判定。纸层析法分析氨基酸专家讲座第5页

三、试验操作

1、纸处理取18cm长、18cm宽滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行线，并等距离在线上定点样点(原点)划圈，使圈直径小于0.4cm。

2、点样用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点2-3次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，预防氨基酸变性降解），点样点直径应控制在2-4mm左右，点样完成用大头针线将滤纸做成筒形，点样面向里。

纸层析法分析氨基酸专家讲座第6页图1.点样2cm纸层析法分析氨基酸专家讲座第7页展层剂展层剂图2.滤纸缝合纸层析法分析氨基酸专家讲座第8页3、平衡点样以后将滤纸与层析缸用配好溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡(30min),不然，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统组分发生改变，严重时纸上会出现不一样水平溶剂前沿，影响层析效果。4、展层向层析缸中加入层析溶剂（高约1.5cm），液层不要超出点样线，将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂抵达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。

纸层析法分析氨基酸专家讲座第9页5、显色用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，热风吹干(加紧反应)反应显色(或晾干后，将滤纸放入烘箱中80-100℃，烘烤5分钟后)，滤纸上即显出紫红色或黄色氨基酸斑点。四、结果处理

1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来。

2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿距离，计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱Rf值。

3、分析混合样品中未知氨基酸组分。纸层析法分析氨基酸专家讲座第10页图3.层析谱

1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿纸层析法分析氨基酸专家讲座第11页五、注意事项

(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，不然手指上氨基酸会造成滤纸上众多斑点。

(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。

(3)点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），预防氨基酸斑点重合。(4)