亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座

内容1、血凝试验(HA)：检测抗原效价2、血凝抑制试验(HI)：检测抗体3、注意事项亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第1页材料

1、90°96孔微量反应板、单道及多道微量移液器、吸头、加样槽、烧杯、吸管、量杯、微量振荡器；

2、H7亚型禽流感抗原、阴阳性血清、稀释液（PBS）；

亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第2页亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第3页实验原理1、HA原理：一些病毒或病毒血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞不流淌）。病毒颗粒红细胞亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第4页2、HI原理：当病毒悬液中加入特异性抗体，且这种抗体量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。Iamlate！抗体抗原亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第5页

血凝试验（HA)

1、血凝板上1-12孔每孔加入25ul生理盐水2、在第1孔内加入25ul抗原，重复吸吹3-5次使其混匀，然后从第一孔吸收25ul加入到第二孔，又重复洗吹3.5次吸收25ul加入到第三孔，依次倍比稀释至第11孔，最终从11孔弃去25ul3、每孔再次加入生理盐水25ul4、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul5、在振荡器上振荡均匀后，放于室温（20-25°C）下静置30分钟，或2-8℃45-60分钟，红细胞对照孔呈纽扣状时判定结果。6、结果判定。将反应板倾斜60°，观察红细胞有没有泪滴状流淌，完全凝集无泪珠状流淌（100%）最高稀释倍数为抗原血凝价。亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第6页1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×红细胞对照生理盐水252525252525252525252525抗原生理盐水25252525252525252525252525252525252525252525弃2525红细胞252525252525252525252525结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+＋＋＋+＋＋＋++++++－－（红细胞沉积在底部）抗原效价测定亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第7页抗原效价29亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第8页4个单位抗原配制比如：抗原效价最高稀释倍数为28（1：256），则4个单位抗原为26，256÷4=1:64，即在63毫升PBS液中加入1毫升抗原即可。亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第9页血凝抑制试验1、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；2、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第10孔，最终从第10孔中吸收25ul弃掉；3、第1－11孔内加入4单位抗原25ul（第11孔为抗原对照第）4、振荡混匀，放于室温中静置30分钟或2-8°50分钟；5、1-12孔每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul（12孔为红细胞对照）；6、振荡，放于室温静置30分钟，或2-8℃45-60分钟；7、结果判定。以完全抑制4个单位抗原最高稀释倍数为该血清HI效价。滴度≤23为阴性，≥24为阳性。8、见下列图亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第10页下列图中抗体效价依次为28、20、25、28亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第11页抗体滴度：9、1、6、0、5、0、0；阳性对照：9亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第12页下列图中抗体效价均为阴性，红细胞对照12孔成立（流淌），11孔抗原对照不流淌。亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第13页1%红细胞悬液制备

采集2-3只健康成年公鸡或无禽流感和新城疫等抗体健康公鸡血液与等体积阿氏保护液（3.8%抗凝剂）混合，用PBS液（生理盐水代替）洗涤3次，吸掉血浆和白细胞膜，每次以3000转/分钟离心3-5分钟，洗至上清液由淡黄色变为透明色。最终用移液器或者刻度吸管吸收压积红细胞泥，用PBS配制成1%悬液，于4℃保留备用。（1份红细胞泥+9份生理盐水）亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第14页阿氏保护液配制：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠0.8克，柠檬酸（枸橼酸）0.055克，氯化钠0.42克，加蒸馏水至100毫升，加热溶解后调PH值至6.1，然后高压灭菌15分钟，2-8°保留备用3.8%抗凝剂配制：枸橼酸钠3.8克，加入蒸馏水100毫升。PBS液：用临床用生理盐水代替。配策略。亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第15页正确操作校准仪器优质试剂标准、规范充分准备！！！检测质量控制办法注意亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第16页注意事项

1、四个单位抗原，红细胞悬液使用过程中要轻轻摇匀；2、移液器吸头在重复洗吹时要插入液面以下但不可过深，防止使用中速度过快产生过多气泡造成移液量降低，每孔混匀完成要将吸头内液体排尽。亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第17页注意事项3、移液器使用时要用力均匀不可过力，吸头要安装牢靠，预防使用过程中漏气或者掉落。吸头尽可能使用一次性，若重复使用要清洗洁净，最好用超声波清洗机清洗，高压灭菌后使用，假如发觉吸头堵住不能吸到液体或者弯曲及时淘汰。4、移液器在滴加液体，尤其是在加抗原和红细胞悬液时一定不要深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，能够尝试悬空垂直加样。亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第18页注意事项

5、4个单位抗原配置一定要准确，假如配置抗原效价高，那么抗体滴度就会低，反之抗体滴度会高，普通现用现配。回归试验来判定效价测定正确是否。做法：做四排，每排1-4孔加入生理盐水50UL，取配好四个单位抗原50UL与第一孔做倍比稀释至最终一孔并弃掉50UL，最终每孔加入50UL红细胞悬液，震荡，静置20分钟观察结果。假如第一和第二孔完全凝集不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，则说明四个单位抗原配制正确。6、红细胞悬液在洗涤过程中一定要把白细胞膜吸收洁净，颜色为鲜红色，假如是暗红色很有可能发生了溶血。假如采集红细胞免疫过禽流感，那么能够多洗涤几遍。红细胞悬液普通情况下能够存放3天，假如要保持一周左右就要在无菌情况下存放在阿氏保护液中。

亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第19页注意事项

7、环境温度一定要重视，普通要求在室温下20-25°进行，假如低于15°反应结果就出现慢；假如高于30°结果会出现快；假如低于4°会发生红细胞自凝现在。所以，观察时间能够适当依据反应情况缩短，所以试验室要装有空调和温度计。

8、微量反应版假如是有机玻璃一定要清洗洁净，孔底要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不洁净反应板在试验中会出现自凝现象。使用正规厂家生产一次性微量板就可杜绝这种情况。

亚型禽流感血凝抑制试验专家讲座第20页注意事项9、整板无红细胞凝集（流淌）现象，给人误认为抗体效价均为12。原因分析：1、4个单位抗原配制过低不足以凝集红细胞；2、环境温度过高；3、