实验动物的微生物学控制课件

实验动物的微生物学控制

普通动物在开放环境中饲养，都会受到自然界微生物、病毒和寄生虫的侵袭，一般都带有细菌、病毒和寄生虫，并感染某些疾病，因此用普通动物做实验，敏感性差，反应性不一致，实验结果不易重复。要提高试验的准确性，必须对实验动物加以微生物学、寄生虫学和遗传学控制，培育出合格的实验动物，使实验结果准确可靠。实验动物的微生物学控制

国际分类法将实验动物分为普通动物、SPF动物、悉生动物、无菌动物4个等级，见表3—1。不同微生物级别的实验动物在生物医学研究中的应用价值有明显的不同，见表3—2。使用无菌动物、悉生动物及SPF动物和清洁级动物，由于有明确的微生物背景和可控的饲育环境，可大大提高动物实验的重复性和准确性。因此，在高标准的实验室应选用微生物学和寄生虫学质量控制较好的无菌动物、悉生动物或无特定病原体动物做实验。实验动物的微生物学控制实验动物的微生物学控制实验动物的微生物学控制第—节无菌动物无菌动物的概念无菌动物(germfree)是指无可检出的—切生命体的动物。进一步说是指用现有的检测技术在动物体内外的仟何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。此种动物在自然界中并不存在，必须用人为的方法培育出来。无菌动物来源剖腹产或无菌卵的孵化、一般将临产前的健康动物用麻醉药品或颈椎脱白法处死后．立即浸泡在37℃灭菌液中，送进无菌室(或无菌隔离器)，按无菌手术进行剖腹，切除带胚胎的子宫(产宫内首先应无菌)，将其浸入消毒液里并输送到另一隔离器中，切开子宫取胎，经用灭菌纱布措拭仔体并断脐后，放隔离器内人工喂乳或用其他品系的无菌母鼠做保姆供养。像小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻烦。故采用保姆代养较为方便。而像豚鼠因在一定程度上能自力饮乳，故人工哺乳较容易。实验动物的微生物学控制

另外，像禽类、鱼类、昆虫类，因是在卵中无菌的前提下进行的，放用药物将卵周围灭菌后移人无菌隔离器内使其孵化即可，而且这些动物—般在出生后能自力采食、故较易育成。无菌动物饲育在无菌隔离器中，经定期检查，证明动物体内外均无一切微生物和寄生虫。实际所谓“无菌”只是一个相对的概念，根据现有的科学知识和检测方法在定时期内不能检出微生物和寄生虫，随着科学技术的发展，现在认为是无菌的动物或许将来可以检出微生物和寄生虫，而不是无菌动物。因此，这个“无”是相对而言的。另外，用大量抗生素也可以使普通动物暂时无菌，但这种动物不是无菌功物。因为这种无菌状态往往是一时性的，某些残留的细菌在适当的条件下又会在体内增殖，即使把体内细菌全部杀死，它们给动物造成的影响却是无法消除的。例如，特异性抗体的存在、网状内皮系统的活化、某些组织成器官的病理变化等。因此，无菌动物必须是生来就是无菌的动物。实验动物的微生物学控制二、无菌动物的发展概况实验动物的微生物学控制实验动物的微生物学控制三、无菌动物的特点（一)形态学的改变1．消化系统无菌动物和普通动物的外观和活动无差异。无菌动物的盲肠(包含内容物)的总重量可达到体重的25％，盲肠的总重量是普通动物的5—10倍。去掉内容物后的盲肠，无菌动物和普通动物之间并没有多大差别。这是无菌动物盲肠壁伸长变薄的结果。这一现象也从组织学方面得到证实。肠蠕动缓慢，食物通过肠道时间长。2．血液循环系统心脏相对变小，白细胞数少，且数量波动范围小。3．免疫系统胸腺和淋巴结处于功能较不活跃的状态，脾脏缩小，无二级滤泡，网状内皮细胞功能下降。无菌动物的免疫功能基本上处于原始状态。实验动物的微生物学控制（二)生理学改变

1．寿命：无菌动物的寿命比普通动物长。普通大鼠寿命2年，而无菌大鼠寿命3～4年。

2．营养：无菌动物体内不能合成维生素D和维生素K。

3生长率：无菌动物的生长率不同种属不一样，无菌禽类生长率比同种普通动物高；无菌大、小鼠与普通动物差不多；无菌豚鼠、兔比普通者慢。可能因肠内无菌，不能帮助消化纤维素以提供机体所需要的营养物质。4．生殖：无菌条件对动物生殖影响不大。实验动物的微生物学控制5.抗辐射能力强:以射线照射无菌小鼠的存活时间长于普通动物，普通动物常因败血症而致死。一般认为，这种存活时间的差别，是由于受损细胞的寿命在无菌与普通小鼠之间存在差别的缘故。6．免疫功能:由于网状内皮系统、淋巴组织发育不良，淋巴小结内缺乏生长中心，产生丙种球蛋白的能力很弱，血清中IgM、IgG少水平低，免疫功能处于原始状态，应答速度慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。实验动物的微生物学控制四、无茵动物在生物医学研究中的应用(一)微生物学研究1．某些疾病的病原研究无菌动物可以提供组织培养的无菌组织，可提供具有某一种菌的已知菌动物，以及研究病原体的致病作用与机体本身内在的关系。如猫瘟的形成，正常猫较易感染猫瘟病毒，无菌猫则不易感染，说明感染受肠道微生物的影响。实验动物的微生物学控制2．微生物间的拮抗作用研究菌群之间的拮抗作用是生物屏障的一种。生物屏障可能比物理屏障更有效。当向无菌动物接种2种或2种以上的细菌时，可以研究它们对动物的协同作用，以及不同微生物之间的相互关系，如依存、拮抗等。实验动物的微生物学控制3．病毒性疾病研究无菌动物是研究病毒性疾病、病毒性质、纯病毒、安全疫苗和单一特异性抗血清的有用工具。实验动物的微生物学控制4．真菌感染研究

临床上较长时间应用某种抗生素，易发生条件性真菌感染的现象，利用无菌动物进行研究得到了一定的阐明。将白色念珠菌经口感染无菌雏鸡时，产生较多菌丝体，并侵入肠道黏膜；但接种普通雏鸡时．只观察到酵母菌体，很少发病。将大肠杆菌接种到无菌雏鸡后就能完全保护雏鸡不受侵犯。用无菌小白鼠实验也得到了类似的情况。实验动物的微生物学控制（二)免疫学研究无菌动物体内既无抗原也无持异性抗体，处于一种“原始状态”，很适合用于各种免疫功能的研究。如无菌动物暴露于微生物，先产生α球蛋白，再产生β球蛋白，最后产生γ球蛋巳。可用无菌动物制备高效价、无交叉反应的特异性抗体，以及用无菌动物进行免疫抑制剂试验研究。实验动物的微生物学控制(三)放射医学研究用无菌动物研究放射线的生物学效应，可以将由放射线所引起的症状和感染而发生的症状区分开来。实验动物的微生物学控制(四)营养、代谢研究无菌动物是研究营养的良好模测，机体必需的某些营养成分是肠道正常菌群生命活动中降解产生提供的。用无菌动物可以研究哪些细菌可以合成哪些营养物质，还可用无菌动物来研究限制饮食对寿命、免疫力的影响等。普通动物的肠道可以合成维生素B和维生素K，应用无菌动物可以研究哪些细菌能够合成维生素B和维生素K。实验动物的微生物学控制(五)老年病学研究方面无菌小鼠的自然寿命比普通小鼠为长，而且雄性无菌小鼠的寿命和雌性的相似或更长些。对2～3年龄无菌大鼠的检查结果表明，肾、心脏和肺实际上没有发生和年龄相关的病变，这说明，微生物因素和机体的老化有关。(六)药物学和毒理学研究药物的毒理作用常常与肠道细菌的代谢产物有关。用无菌动物进行研究，可以准确地分析药物的毒理作用和药物的合理使用。实验动物的微生物学控制五、无菌动物的培育

无菌动物在自然界并不存在，必须用人为的方法培育而成。现在通用的无菌动物培育方法是生物净化法，即剖腹产技术。原理是胎盘的屏障作用，母体一般不会将细菌、病毒等致病微生物传给胎仔。在无菌条件下，大动物进行子宫切开术，小动物做子宫切除术，取出胎仔，获得无菌动物，并将获得的无菌动物置入到无菌隔离器中哺育。实验动物的微生物学控制（一)哺乳类无菌动物技术

1．预产期的判断预产期的判断相当重要，手术过早，胎仔很难成活；手术过晚，子宫颈开放，胎膜破裂，胎仔遭产道菌污染。最适时间应掌握在自然分娩前2～6h。实验动物的微生物学控制2．剖腹产术：手术时应采用无菌操作，在短时间内完成剖腹产手术。手术过程：将母体麻醉或颈椎脱臼处死后，立即进行消毒、剖腹。一般小鼠采用颈椎脱臼法，处死孕鼠后，迅速将其浸入37℃消毒液中5s，移至手术台上。固定四肢，切开腹部，暴露子宫，用止血钳分别夹住两侧输卵管和子宫颈，用剪刀剪下，然后将子宫连同止血钳放入灭菌液中浸泡5s．再传入隔离器中，洗去消毒液后切开子宫取出胎仔。通常要求大、小鼠最迟不应超过10min，胎鼠因耐缺氧能力差，不应超过5min，时间过长胎仔容易窒息死亡。实验动物的微生物学控制3．哺乳：有2种方法即人工哺乳法和代乳法。

(1)人工哺乳法：在没有代乳鼠的情况下，采用人工喂乳是唯一的方法。人工喂乳最初7天每天喂6次，每次间隔4h，8日龄后每日喂5次。人工乳汁的配方：家免乳或山羊乳作为大、小鼠人工乳，灭菌后饲喂。实验动物的微生物学控制(2)代乳法：剖腹产术获得胎仔，由哺乳中的无菌小鼠给予代乳哺育，就能使别的品系的普通小鼠无菌化。代乳母鼠的分娩时间应控制在剖腹产的前l—2天。将乳母的幼仔部分成全部取出，换入新生仔鼠，将代乳母鼠笼小的铺缺物充分分散到被代乳仟鼠身上，并将仔鼠轻放于代乳鼠腋下，仔细观察，确认被代乳仔鼠吮吸代乳鼠的乳汁则视力代乳成功。代乳时间一般4周龄则可离乳。无菌检测：对代乳鼠、被代乳鼠的元菌检测，应在手术后的第7、12及25天进行，这对于了解动物体内的微生物状况，保证动物的质量极为重要。实验动物的微生物学控制(二)鸟、禽类无菌动物培育技术鸡、鸽等也是常用的实验动物。培育该类无菌动物相对来说较无菌鼠兔容易。因为这些动物出壳后即可啄食，不需人工喂养。无菌化的关键在于卵壳，因为卯壳不光滑不易消毒灭菌，因而在选择蛋类时应选择新鲜外壳光滑的受精卵。按如下程序无菌化：①将受精卵放到预先加温至38℃的湿润剂中；②再放入2％升汞液中浸泡12min，上面加无菌纱布覆盖；③将浸泡过的受精卵放入隔离器中孵育。研究营养用无菌鸡，要选育无白血病的鸡群，否则仅外壳消毒是消灭不了鸡白血病病毒的。实验动物的微生物学控制六、无菌动物的饲料及饲养环境1．无菌动物的饲料无菌动物的饲料须符合如下要求：①无菌动物的饲料，以及垫料、饮水及其他用品均须经过严格的灭菌消毒，杀灭活的微生物和寄生虫；②必须补充因高压灭菌而破坏的饲料营养成分，如维生素B、维生素c、泛酸等，补充的营养成分需用滤菌器过滤除菌；③饲料的组成、形态和气味等应尽可能适合动物的习性和嗜好；④在饲料中补充肠道正常菌丛合成的营养成分。实验动物的微生物学控制2．无菌动物的饲育装置无菌动物必须生活在与自然界微生物完全隔绝的无菌隔离器内，故隔离器又称绝对屏障系统。无菌隔离器是—个对微生物绝对密闭的容器，其内部空间和内容物能接受高压蒸气灭菌或化学药品灭菌处理；装有无菌通道(传递窗)，动物或食物及其他物品都可以从外部无菌地输送到隔离器内部去，而不破坏内部的无菌环境；装有高效过滤的装置，而且隔离器内的一切情况可随时被观察。实验动物的微生物学控制3．无菌动物的检查为了确保无菌动物的无菌状态．及时发现污染，必须定期进行检查。检查的材料以粪便为丰，亦可检查饲料、垫料、饮水等，或者用消毒棉擦拭隔离器内壁或动物的饮水器皿表面进行培养。培养基可用牛肉浸液、硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂等．分别在做厌氧和需氧培养。同时还要进行寄生虫及病毒检查。但是，对于病毒．不可能一一进行分离培养，一般通过临床观察、细菌培养或病理组织学检查来相对地判定无菌动物有无污染。当然，无菌动物是—个相对概念，实际上有的病毒、细菌、寄生虫可以通过胎盘屏障传给子代。实验动物的微生物学控制第二节悉生动物一、悉生动物的概念悉生动物也称已知菌动物或已知菌丛动物，是指在无菌动物体内，植入已知微生物的动物。根据植入无菌动物体内菌落数目的不同，悉体动物可分为单菌、双菌、三菌和多菌动物。实验动物的微生物学控制悉生动物来源于无菌动物，一般供实验用的悉生动物，不同国家人工接种的肠道细菌种类也不同。常用的有粪链球菌、脆弱拟杆菌、双歧杆菌、费新尼亚梭茵、乳酸杆菌、葡萄球菌等。广义的悉生动物包括三大类：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物。狭义的悉生动物仅指悉生动物。按照我国的微生物学和寄生虫学控制分类，悉生动物属于四级动物，必须饲养于隔离器系统中。实验动物的微生物学控制二、悉生动物的特点

悉生动物体内带有已知微生物，和无菌动物一样，均饲养在无菌隔离器中，饲养管理方法同无菌动物，但悉生动物可以弥补无菌动物的某些缺点。悉生动物肠道内存在能合成某种维生素利氨基酸的细菌，尽管高压灭菌过的饲料不能供给足够的维生素，但悉生动物不会发生维生素缺乏症。无菌动物抵抗力较弱，饲养管理困难，而悉生动物抵抗力明显增强．易饲养管理，在多种研究中可代替无菌动物。实验动物的微生物学控制三．悉生动物的应用1．微生物学研究：悉生动物在微生物学研究中做出了突出的贡献，科研工作者可以根据实验研究的需要，有目的地喂给单一的或多种细菌，来观察这些细茵对机体的作用，亦可观察微生物与微生物之间及微生物与机体之间的相互关系以及菌群失调现象等。当向悉生动物施以物理、化学等其他致病因子时，则可观察机体、微生物、致病因子三方面的相互作用关系。实验动物的微生物学控制2．免疫学研究最新研究表明，普通动物消化道内有100～200种细菌，取1g肠内容物有106～1012个菌，一种细菌就是一种抗原，因此用普通动物很难制备较纯的抗体。无菌动物缺乏抗原刺激，免疫系统处于体眠状态，对外来刺激非常敏感，只有对某种抗原可迅速做出反应的特性。如果将单一菌株植入无菌动物，那么就可以制备抗该种菌的纯度高、效价高的且不会污染其他微生物的抗体。实验动物的微生物学控制3．微生物和寄生虫相互关系的研究很多实验研究表明，宿主消化道的微生物状况，直接或间接影响寄生虫在宿主体内的寄生能力。

4．克山病病因学研究中国农业大学用植入黄曲霉菌动物的实验研究证明，动物的症状与克山病人的症状相似，硒不足只能加重病情．而不会诱发克山病；实验动物的微生物学控制5．公共他方向的应用悉生动物现巳被广泛应用于人和动物的骨髓移植，人和实验动物的肿瘤及其治疗，病毒学和肿瘤疾病等方面的研究。实验动物的微生物学控制四、悉生动物的饲养管理必须饲养在温湿度恒定的百级空气净化的隔离系统中，实行严格的微生物学和寄生虫学控制。饲养管理方法与无菌动物相同。实验动物的微生物学控制第三节无特定病原体动物无特定病原体动物的概念无特定病原体动物(SPF)简称SPF动物，是指动物机体内无特定的微生物和寄生虫存在，但带有非特定的微生物和寄生虫的动物。实际上是无传染病的健康功物。SPF动物来源于无菌动物，必须饲养在屏障系统中，实行严格的饲养管理和微生物学及寄生虫学控制。按照我国的实验动物微生物分类方法，SPF动物除普通动物、清洁动物应排除的病原体外，还应排除具有主要潜在感染或条件致病菌和对科研实验干扰大的病原菌。SPF动物原始种群来源于无菌动物、悉生动物。实验动物的微生物学控制

目前国际上对SPF动物的监测标准均不一致。部分学者认为某种实验动物没有某种病原体，不影响其实验要求就可称为SPF动物。另有学者认为必须将常见的病原体全部排除才算是真正的SPF动物。前者要求太低，后者要求太高。结合我国的实际情况，以既排除对动物群有危害的病原体、又排除对动物实验研究有干扰的微生物和寄生虫为原则。由此可见，我国的SPF动物微生物学和寄生虫学质量控制标准高于国外的控制标准。实验动物的微生物学控制二、无特定病原体动物的用途SPF动物排除了各种致病菌，因此试验结果准确可靠。目前国际上公认SPF动物适用于所有科研实验，是国际标准级别的实验动物。它的应用价值在于它无人畜共患病，无主要传染病，无对实验研究时能产生干扰的微生物。目前，SPF动物已广泛应用于各个领域。实验动物的微生物学控制1．生物医学研究:在药理学、毒理学、肿瘤免疫学及传染病学等学科的研究中，SPF动物为首选动物。2.血清、疫苗生产:细菌、病毒诊断血清，各种疫苗生产所采用的动物应为SPF动物，如SPF蛋(无垂直感染)。3.生物学鉴定:狂犬疫苗要用SPF小鼠；结核菌素要用SPF小鼠进行生物学鉴定。实验动物的微生物学控制三、无特定病原体动物的培育

和饲养管理l、SPF动物必须饲养在屏障系统内培育SPF动物的目的是为实验研究提供健康无病的动物。因此，SPF动物饲养于在温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中、实行严格的微生物学和寄生虫学控制。其饲育设施有：SPF级动物房、超净生物层流架、带空气过滤帽的饲养盒等。使用的设施应定期按规定的检测内容和方法来检查有无致病菌(即特定的病原体)的污染，如有污染，其动物视不同情况应降低等级使用或全部淘汰，并要查明污染原因及时采取防范措施。在屏障系统内工作的人员亦应经常进行健康检查。实验动物的微生物学控制SPF动物的饲养环境中没有致病微生物，所以其生产的效果比普通动物好，生产效率高，饲养过程中损失小。但屏障系统一旦遭到污染，病原体的传播却更强烈，所以，保持屏障系统的完好是非常重要的。实验动物的微生物学控制2、必须严格选择原种动物建立SPF动物种群，其原种必须来源于无菌动物或悉生动物才能保证。即将无菌动物或悉生动物放在屏障系统中饲养，使之自然感染特殊病原体以外的一般微生物。某些病原体可以通过胎盘屏障传给胎仔(如致瘤病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒等)，这个问题在培养SPF动物原种时应充分考虑。要严格选择动物剖腹产母体，该动物应末感染能通过胎盘屏障的微生物，最好通过几代连续剖腹产来培育原种无菌动物，从而作为培育SPF动物的原种。实验动物的微生物学控制3．必须严格掌握SPF动物的质量标准

SPF动物必须首先排除各种人畜共患的传染病病原体，还应排除影响该种动物生产和实验使用中产生干扰的病原体，定期按规定的标准检测是保证实验动物质量的重要措施。实验动物的微生物学控制第四节清洁级动物一、清洁级动物的概念清洁级动物(cleananimals,CL)是指除普通动物应排除的病原外，不携带别动物危害大和对科学研究干扰大的病原体，是根据我国国情而设定的等级动物。其种群来源于SPF动物、无菌动物或剖腹产动物。实验动物的微生物学控制二、清洁级动物的特点清洁级动物比普通级动物要求排除的微生物和寄生虫多，但比SPF动物少。清洁级动物除肉眼观察无病外，尸体解剖时，主要脏器、组织无论是肉眼观看还是病理组织切片均应无病变。实验动物的微生物学控制三、清洁级动物的应用国际上普遍认为清洁级动物是按照微生物学和寄生虫学控制要求最低的动物其为清洁普通级动物，仅适合于短期试验或部分科学研究实验。实验动物的微生物学控制四、清洁级动物的饲养管理清洁级动物饲养于温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中。其所用的饲料、垫料、饮用水、笼器具等都经过消毒灭菌处理。饮水可用高压灭茵水或采用PH值2.5～2.8的酸化水。空气也需经初、中、高效过滤，工作人员需换灭菌工作服、鞋、帽、口罩等进入动物室进行操作。实验动物的微生物学控制第五节普通级动物一、普通级动物的概念普通级动物(conventionalanimals，CV)是在微生物学和寄生虫学控制上要求最低的动物，它要求不携带人兽共患病和动物烈性传染病的病原体。这类动物是微生物学和寄生虫学控制要求最低的动物，饲育在开放环境设施中。我国现行的实验动物国家标准中取消了大、小鼠的普通级，原鼠、地鼠、免、犬、猴仍保留有普通级。它的优点是生产成本低，一般场所即可饲养。实验动物的微生物学控制二、普通级动物的用造普通级动物是实验动物微生物学和寄生虫学控制要求最低的动物，对实验结果的反应较差，多用于生物医学教学示教，或作为某些科学研究为探索方法而从事的预试验之用，以及豚鼠、免、犬、猴等大动物的实验研究。不可用于科研、生产和鉴定。实验动物的微生物学控制三、普通级动物的饲养管理普通级动物饲养在开放系统中，动物室内温度、湿度良好，室内通风良好。为预防人兽共患病及动物烈性传染病的发生，日常饲养及管理必须采取一定的防护措施。要求饲料、饲具消毒，防止野生动物(野鼠)的入侵，饮水要符合城市饮水卫生标准；饲料应经清洗消毒后再喂；外来动物必须严格隔离检疫；房屋要有防野鼠、防昆虫的设备；要坚持经常性的环境卫生及笼器具的清洗消毒，严格处理淘汰及死亡动物；限制无关人员进入动物室。实验动物的微生物学控制第六节实验动物微生物学及寄生虫学质量监测一、检测意义定期进行微生物学及寄生虫学监测，以确定实验动物是否符合原定级别质量。监测可以避免人兽共患病原感染，保护人员健康。监测可以避免误用不合适的动物，确保动物实验结果准确可靠。实验动物的微生物学控制二、微生物学及寄生虫学监测等级国家标准监测标准的制定是提高实验动物质量的重要前提。有了明确的等级标准，饲养管理人员才能按照标准对实验动物的饲养环境、饲料和设施条件进行改善，才能制定相应的饲养管理制度。检疫人员才能按照标准对实验动物进行相应病原体的检测，及时发现问题，提出净化和改进的建议。实验动物的微生物学控制级别越高的实验动物，监测的微生物和寄生虫的种类就越多。根据近10年来我国实验动物感染病原微生物和寄生虫的底样