食品中转基因植物成分定性PCR检测方法

食品中转基因植物成分定性PCR检测方法2CrylA(e)(theerylAclgeneencodinganinsecticidalerystalproteinfrom编码苏云金杆菌杀虫结晶蛋白的erylAcl基因，又称CrylA(c)基因CryⅢA(theery3AalgeneencodlinganinseeticidalcrystalproteinfromBacil码苏云金杆菌杀虫结晶蛋白的ery3Aal基因，又称CryⅢA基因EDTA(ethylenediaminetetraacetieacid);乙二胺四乙酸EPSPS(5-enolpyruvylshkimate-3-phosphatesynthasegene);5-菲草酸-3-磷酸合酶基因FAM(6-carboxyfluorescein);6-羧基荧光素FMV35S(35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus);经修饰的玄参花叶病毒35S启GOS(aroot-specifiericegenehighlyexpressedinrootsfromseedlingsandmatureencodesa14kDaprotein):编码一个14kDn蛋白质、在幼苗和成熟植株根部高度表达的水稻种属特异性HEX(5-hexachloro-fluorescein);5-六氯荧光素Leetin:植物凝集素基因LA(linearacrylamide);线状丙烯酰胺NOS(terminatorofnopalinesynthasegene);胭脂碱合酶基因终止子NPTll(neomycinphosphotransferasellgeneoraminoglycoside新毒素磷酸转移酶基因，也称氨基糖苷3'磷酸转移酶基因PAT(phasphinothricinacetyltransferasegene);草丁膦乙酸转移酶基因tatin(thegeneencodinganapproximately40-kDaglycoproteinwhichconstitutesuptofthesolublepotatotuberprotein):编码一种分子量约40kDn的糖蛋白的基因，该糖蛋白占马铃薯块茎PG(polygalncturonasegene);多聚半乳糖醛酸酶基因PLD(ricespecifiephospholipaseDgene):水稻特异性磷脂酶D基因SPSCricespecifiesucrosephosphatesynthasegene);水稻特异性蔗糖磷酸合酶基因PVY-cp(potatoYviruscoatproteingene);马铃薯Y病毒外壳蛋白基因ROX(carboxy-X-rhodamine);羧基-X-罗丹朋Tag(Thermusaquaticu);水生栖热菌TAMRA(carboxy-tetramethyl-rhodamine);羧基四甲基罗丹明TE₂TrisHCl,EDTA缓冲液tRNALeu:叶绿体亮氨酸转运核糖核酸基因Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethane]:三(羟甲基)氨基甲烷UNG酶(Uracil-N-glyeosylase);尿嘧啶DNA-糖基化酶ZEIN:玉米醇溶蛋白基因。4防止污染措施防止污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5抽样与制样抽样与制样方法应符合GB/T19495,7和GB/T19495,3中的相关规定。36测定方法对样品进行DNA提取和纯化，使之适用于PCR检测技术，通过善通PCR或实时荧光PCR.检测其中是否含有各种外源基因，达到对食品中转基因植物成分定性PCR检测的目的。6.2主要仪器6.2.1均质器(可拆卸、可清洗、可高压灭菌)或研钵。6.2.2电子天平：感量0.001g。6.2.3高速冷冻离心机(最高转速55000g)。6.2.4台式离心机(最高转速15000g)。6.2.5微型个人离心机。6.2.6双温水浴(37℃±1℃,65℃±1℃)。6.2.7制冰机。6.2.8涡旋振荡器。6.2.9冰箱(2℃~8℃、-20℃.-80℃)。6.2.10超纯水发生器(分子生物学级别)。6.2.11双蒸水器。6.2.12生物安全柜。6.2.13高压灭菌锅。6.2.14核酸真空干燥系统。6.2.15核酸蛋白分析仪。6.2.17实时荧光PCR仪。6.2.18电泳仪。6.2.19凝胶成像仪。6.2.20微量可调移液器及配套吸头(2.5μL～10μl.,2gL~20gL,10pL.～100pL.,50pL~200pL、6.2.21离心管(1.5mL.,2mL,15mL.,50mL}。6.2.22光化学PCR反应管。6.3主要试剂6.3.1除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、贮存应符合GB/T27025的规定。6.3.2实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。去离子水电阻应达到18,2Ω。6.3.3琼脂糖。6.3.4RNaseA酶溶液：冻干品，不含DNase,用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为10g/L的溶液，分装后于—20℃保存，避免反复冻融。6.3.5CTAB-1提取缓冲液；CTAB20g/L,氯化钠81.9g/L,Tris12.1g/L,Na₂-EDTA7.5g/L,PVP-4020g/L·pH8.0.高压灭菌。使用前加入终浓度为2%的殖基乙醇。6.3.6CTAB2提取缓冲液：CTAB20g/L,氯化钠81.9g/L,Tris12.1g/L.Na₂-EDTA7.5g/L,pH8.0,高压灭菌。5'-gecetetactecscerec5'-gcccatctgcnsgcctt5'-ergctgtateacsaggget5'-ggngccegtgtagngcntgar5'-tgacctggacwccncag5-gtggatttesggagttet5'-ggatecttagangcntctagt-3”5'-cgmggtgeateectgc5'-crcanraacaacracrgttca-3’5'-cgannteggtngacgc5表1(续)5'-angncatecaccgnngn5'-ctcaccttgctecteegaga-3’5*-cgccttgagcctggrgg5'-gtegacntgtctecgg3'-tgatgtgatstetecaet5'-tgtatecettgagccatg5'-agtutcettttigttgete5'-gatgtttgggttgttgt5'-ctetegetgttcatgtteg5*-ggtcaggctcaggetg5'-atggtggatggcatgat5*-crtegeangaceetteetr5'-ecttegeangneeetteete5'-crtaattcecttatct5'-tctegntetttggcctt5'-tgeagcexagxttatrg5*-acggiggangagttcastg5'-cractgargtangnga5'-ggatcettagangeate5'-cntegcangactggcs表1(续)S'-gttecngctacugeticct5'-ecactasagtttetaacac5'-anscngacnsaantng5'-gaatesnggctateac5'-cnteegenetgcetca5'-agagecgtcgcnacacc食品中转基因植物成分普通PCR检测，应根据食品成分来源，确定转基因番茄Zenem*的基因组DNA使用该对引物进行普通PCR反应可以同时扩增出383bp和180不同大小的DNA片段；半转基国番茄的基因组DNA只能表2食品中转基因植物成分实时荧光PCR检测所用引物序列和探针序列5'-cetertegggaasgttS'-eretegietetigglegcgceet8'-Lguncecstgcatgea5'-tggrgtgtccgtccctg5”sugcag'gtggttggttctS'-agngtecacnsgtgetre5'-gncgcacggacgacgg5'-cggttgatettttegg8'-tggtgngcgnttgengt5'-tgttgtgctgccnatgtgg5'-tceegengceeeaacas8'-ttettgcalggltcacctg3'-caaggrggergnsatangt5'-ggtgttexterattgeg5'-cgnsateggtagncgc5'-tecattgagtetetgc5-tggacecccacecscgggag5'-Bsgmcatccaccgnag-tggtceccacgcengetgetrg5'categraagacrggcsa大豆，玉来、眷茄.5-cncecagccggcencagt5°-cegagccgcaggawcgca5*-gtegacstgtetecgg5'-tggxgcggtttgTgAta5'-cugrgtgccgntggecte5'-cgcg1ggutcaggtnca-3’5'-crgregxgagrtgccrtgw'-tggggancaggeucacgat-3”5'-acetatgetcsagelgecasc5'-centagntttgngegte5'-ncntgaacngcgcettgacca6.4.2.2样品前处理加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式的样品前处理尽量去除样品中的盐、糖和色素。取适量样品加入50mL离心管，加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒充分混匀.7200g离心5min并弃去上清液，重新加入约2倍体积的双燕水，上下颠倒混匀，7200g离心5min并弃去上清液；重复洗涤操作步骤3次～5次。乳浊或悬浊状的液体食品样品，如茄汁、番茄酱(稀)、豆奶、豆浆等，可以通过物理方式破坏胶体稳定性并分离，浓缩。取适量样品加入2mL离心管，7200g离心5min并弃去上清液：再次加入适量样品，7200g离心5min并奔去上清液：重复上述操作步骤3次～5次。6.4.2.3样品均质采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。6.4.3DNA提取和纯化6.4.3.1空白对照的设置DNA提取和纯化过程应设置核酸提取空白对照，具体方式按照GB/T19495,2中相关规定进行。6.4.3.2DNA溶液的保存提取和纯化后的DNA溶液长期保存应储存-20℃或低于-20℃,按照GB/T19495.3中规定的方法进行。6.4.3.4试剂盒法采用商品化的植物基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。DNA定量方法按照GB/T19495.3中相关规定进行。6.4.5.1对照设置PCR检测过程中应设置PCR扩增试剂空白对照、PCR扩增阴性目标DNA对照、PCR扩增阳性目标DNA对照，并对DNA提取和纯化过程中设置的核酸提取空自对照同时进行PCR检测，具体方式按照GB/T19495.2中相关规定。食品中转基因植物成分的定性PCR检测，按照PCR反应类型，分为普通PCR检测和实时荧光PCR检测。普通PCR检测阳性结果应进一步进行确证实验，实时荧光PCR检测阳性结果无需进行其他确证实验。6.4.5.3内源基因检测为降低检测成本、避免无效操作，定性PCR检测时可先进行内源基因检测，检测结果阳性表明从样9品中提取出适宜进行PCR检测的DNA,可以进行外源基因检测；否则表明未能从样品中提取出适宜进行PCR检测的DNA.应重新进行DNA提取和纯化，6.4.5.4.1适用范围普通PCR检测适用于DNA破碎程度较低，DNA含量较高的食品样品，如食品原料和粗加工6.4.5.4.2普通PCR反应体系普通PCR反应体系见表3。每个样品进行普通PCR检测时应设置2个平行。表3普通PCR反应体系氧化镁溶液(25mmol/L)dNTP溶液(各2,5mmol/L)正向引物(20pmol/L)反向引物(20gmal/L)注1:UNG酶在活化条件下可以降解含有dU的双链或单链DNA。在PCR扩增反应液中加入UNG效防止以前以dUTP代替dTTP合成的PCR扩增产物所致的遗留污染。实验室如果选择为防止污染措施，可在每次PCR反应的反应体系中以dUTP代替dTTP井加入UNG酶：否中不必加人UNG酶-dNTP溶液为dATP,dCTP,dGTP和dTTP6.4.5.4.3普通PCR反应循环参数普通PCR反应循环参数见表4,使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。表4普通PCR反应循环参数95℃预变性5min,95℃变性30s.50℃退火30s.72℃迁伸602.35个循环95℃预变性5min。95℃变性30s,64℃退火30s,72℃送伸60s,35个循环94℃预变性3min。94℃变性408.55℃退火60x.72℃延伸60xn35个循环94℃预变性3min。94℃变性308.60℃退火308.72℃还伸308,30个循环94℃预变性Smin。94℃变性30s,61℃退火60s,72℃廷伸90s,35个循环95℃预变性10min,95℃变性30s.63℃退火30s,72℃延伸30s,40个循94℃预变性4min。95℃变性308.55℃基火30s.72℃还伸608.30个缩环94℃预变性3min。94℃变性20x.54℃退火40s.72℃延伸60*,40个循环95℃预变性5min。94℃变性208.60℃退火408.72℃还伸408.40个循环94℃预变性Smin。94℃变性60s,58℃退火60s,72℃廷伸60s,35个循环94℃预变性2min。94℃变性40s,56℃退火60s.72℃运伸60s,35个循环95℃预变性5min。94℃变性30s,60℃退火60x,72℃运伸60s,35个循环94℃预变性10min,94℃变性308-50℃退火408.72℃延忡608.40个循95℃预变性10min。94℃变性15s,60℃退火40s,72℃延伸60s,40个循94℃预变性3min。94℃变性40s.55℃起火45s.72℃还伸458.35个循环缓冲液浓度为1×。将混合物点样，并根据PCR扩增目标片段大小选择合适的DNA分子量标记点样。8V/em~10V/em恒压电泳20min~40min。用凝收成像仪观察、记录并分析结果。6.4.5.4.5确证实验普通PCR扩增产物经凝胶电泳检测为阳性结果的，还应通过下列的方法之一进行确证；—用特异DNA探针进行杂交：—PCR产物的限制性内切酶酶切分析：——PCR产物序列测定：——实时荧光PCR检测(采用6.4.4.2的方法):——其他验证方法。6.4.5.5实时荧光PCR检测6.4.5.5.1适用范围实时荧光PCR检测适用于DNA破碎程度较高、DNA含量较低的食品样品，如食品成品和深加工食品。6.4.5.5.2实时荧光PCR反应体系。实时荧光PCR反应体系见表5。每个样品进行实时荧光PCR检测时应设置2个平行。表5实时荧光PCR反应体系氧化镁溶液(25mmol/l.)dNTP溶液(各2.5-mmol/L)正向引物(20cmol/L)反向引物(20pmal/L)探针(10μmol/L)注1:UNG酶在活化条件下可以降解含有dU的双链或单链DNA。在PCR扩增反应液中加入UNG效防止以前以dUTP代替dTTP合成的PCR扩增产物所致的造留污染。实验室如果选择为防止污染措施，可在每次PCR反应的反应体系中以dUTP代替dTTP井加入UNG酶；否中不必加入UNG酶，dNTP溶液为dATP,dCTP,dGTP和dTTP的混合物。注2:反应体系中各试剂的量可根据反应体系的6.4.5.5.3实时荧光PCR反应循环参数实时荧光PCR反应循环参数见表6。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。表6实时荧光PCR反应循环参数²湿度/℃6.4.5.5.4仪器检测通道的选择设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。6.5结果判断6.5.1普通PCR检测结果判断6.5.1.1质量控制6.5.1.1.1基本原则实验中设置的各种对照PCR扩增产物凝胶电泳检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非6.5.1.1.2~6.5.1.1.4所述正常结果，应重做实验。6.5.1.1.2核酸提取空白对照和PCR扩增试剂空白对照内源基因检测结果阴性.外源基因检测结果阴性。6.5.1.1.3PCR扩增阴性目标DNA对照内源基因检测结果阳性，外源基因检测结果阴性6.5.1.1.4PCR扩增阳性目标DNA对照内源基因检测结果阳性，外源基因检测结果阳性。6.5.1.2结果判断6.5.1.2.1样品内源基因检测结果阴性，表明未能从样品中提取出适宜进行普通PCK检测的DNA或所提取的DNA中存在PCR反应抑制因子，应重新提取DNA。6.5.1.2.2样品内源基因检测结果阳性，外源基因检测结果阴性，表明从样品中提取出适宜进行普通PCR检测的DNA,可以判断样品中未检出×××基因。6.5.1.2.3样品内源基因检测结果和外源检测结果均为阳性，表明从样品中提取出适宜进行普通PCR检测的DNA,且样品DNA中可能含有×××基因，应进一步进行确证实验。确证实验结果阳性，可以判断样品中检出×××基因。否则，可以判断样品中未检出×××基因。6.5.2实时荧光P