海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程-地方标准编制说明

规程》(一)任务来源2020年7月，山东省市场监督管理局标准化管理委员会发布《关于印发2020年度地方标准制修订计划项目的通知X鲁市监标字【2020】249号),下达山东省地方标准《海洋生物资源遗传多样性监测技术规范》制定任务，由山东省海洋局提出并组织实施，山东省海洋标准化技术委员会归口，山东省海洋资源与环境研究院负责本项目的起草制定工作，项目编号213。(二)起草单位、起草人及任务分工接到《海洋生物资源遗传多样性监测技术规范》省级地方标准制定任务后，山东省海洋资源与环境研究院联合海阳市海洋与渔业综合服务中心，组织长期从事标准制修订、海洋生态环境监测、资源调查评价、生物遗传多样性研究、海洋生物资源保护的一线工作人员，成1、起草单位项目承担单位山东省海洋资源与环境研究院有60多年海洋与渔业科研历史，在我省海洋资源与环境调查、开发、保护，海域海岛可持续利用，海洋生物与遗传育种等领域发挥了积极作用。下属山东省海洋环境监测中心多年来一直作为山东省海洋环境监测和评价总牵头单位，渔业资源研究中心主要从事海洋渔业资源调查评估、海洋生物资源修复等领域研究，先后承担多项国家海洋公益性行业科研专项、农业部生态修复项目等，已对刺参、海胆、单环刺螠、中国明对虾、三疣梭子蟹等十余个重要经济海洋生物资源开展遗传多样性研究，具备扎实的工作基础。先后制定国家、行业、地方标准20余项，具有丰富的标准使用和制修订实践经验。本项目所有参与者都是长期从事海洋环境监测、资源调查评价、生物遗传多样性研究的一线工作人员，参与多项标准的制定，技术力量雄厚，可以胜任该项标准制定工作。中心现拥有荧光定量PCR仪、液氮冷冻研磨仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统等先进设备共计200多台(套),仪器设备先进完备。项目合作单位海阳市海洋与渔业综合服务中心，为全市海洋与渔业发展提供渔业技术推广、海洋环境监测、海洋预报、海洋减灾等综合服务工作和海洋与渔业保护区组建、管理等服务工作。具有丰富的王玮云：负责调查研究、标准内容设计、标准草案起草和修改等刘爱英：参与样品分类、标准修改工作：(三)起草过程1、基础工作标准申请前，收集相关参考文献资料，包括专著、国内外公开发布论文、科研成果和现有技术规范标准，比较筛选适用的遗传多样性监测方法；汇总实验室多年来的遗传多样性研究结果，同时通过NCBIgenbank数据库搜索下载海洋生物序列结果，验证不同分子标记作为种内遗传多样性应用的可行性，初步确定了标准的技术内容。2、标准草案编写标准立项后成立标准起草小组，明确主要起草人及任务分工。收集了多种海洋动物，根据形态学分类后开展了D-loop、COI、16SrDNA序列检测，获得了翔实可靠的数据，在此基础上广泛参考现有研究资3、征求意见稿编写标准草案经起草小组讨论、修改，2022年6月形成标准征求意见2022年7月，标准专家征求意见稿送科研院所、高校、企业等共30家单位书面征求意见。2022年9月，共收到35位专家反馈，其中提出修改建议的专家30位，无意见专家5位，合计技术性意见和建议81条。2022年10月，标准征求意见稿在山东省海洋标准化技术委员会网站上公示，并在海标委的指导下，根据专家意见和建议完成标准文本及编制说明征求意见稿的修改工作，材料提交海标委准备参加论证会。5、标准送审稿形成2022年11月12日，山东省海洋标准化技术委员会组织在烟台召开标准论证会，会议邀请6位专家参加，并提出修改建议，根据会上专家提出的意见和建议完成标准文本及编制说明的修改工作，形成标6、标准报批稿形成2023年8月31日，山东省海洋局在烟台组织召开标准专家审查会议。会议邀请9名专家组成了审查委员会。审查委员会听取了标准编制情况汇报，对标准文本进行了逐章、逐条审查，对标准编制说明等进行了审查，共提出修改建议20条。根据专家提出的意见和建议完成标准文本及编制说明的修改工作，形成标准报批稿。7、标准名称变更说明《海洋生物资源遗传多样性监测技术规范》标准草案编制过程中发现，由于海洋生物种类繁多，即使同样选择单核苷酸多样性(SNP)分子标记，其DNA提取方法和遗传多样性检测条件差异很大，标准内容更侧重于海洋生物资源遗传多样性监测的程序与相关技术要求，因此征求意见稿标准名称修改为《海洋生物资源遗传多样性监测技术规程》;多位专家反馈意见和现场论证专家一致认为，海洋生物范围太广，不同类别生物差异巨大，应分别制定遗传多样性监测标准，建议该标准名称改为《海洋动物物资源遗传多样性监测技术规程》;标准审查会上，专家建议进一步明确，标准名称最终修改为《海洋动物物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程》,报批稿名称和内容即按二、地方标准制定目的和意义生物多样性是人类生存和发展、人与自然和谐共生的重要基础。2011年，我国通过了《联合国生物多样性十年中国行动方案》,将生物多样性保护上升为国家战略。《中国生物多样性保护战略与行动计划(2011-2030)》指出：海洋及海岸带物种及其栖息地不断丧失，海洋渔业资源减少，部分珍贵和特有鱼种质资源流失严重，一些地方传统和稀有品种资源丧失。对已完成的大型建设项目开展生物多样性保护措施有效性的后评估、开展生物物种资源和生态系统本底调查、开展生物多样性监测和预警为我国生物多样性保护的优先行动之一。生物多样性由遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性组成。其中遗传多样性是指生物体内决定性状的遗传因子及其组合的多样性，是生物多样性的基础，也是生物生存适应和发展进化的前提。一个居群或物种遗传多样性越高，对环境变化的适应能力就越强。遗传多样性也是保护生物学研究的核心之一，对保护受威胁的物种和珍稀濒危物种保护方针和措施的制定具有重要意义。随着社会经济的飞速发展，人类活动对海洋生物资源的影响越来越明显，主要表现在：一、大量的围填海和其他海洋工程挤占海洋生物的生存空间；二、工、农业生产和生活污水的排放造成的污染威胁海洋生物生活环境；三、对海洋经济生物的过度捕捞使其资源量锐减；四、连续多年大规模的增殖放流活动对部分经济海洋生物资源量的补充。这些人为干预都可能对海洋生物的遗传多样性产生影响。我国目前开展的海洋生态调查工作中，以浮游动植物、底栖生物的物种多样性为主，对海洋渔业资源调查也主要侧重于生物种类、密另一方面也是因为缺少相应的监测方法和评价标准。为全面评价海洋生物资源状况，为海洋资源保护工作提供技术支持，急需制定海洋生物资源遗传多样性监测技术规程。本标准的制定，解决了海洋动物资源调查中遗传多样性监测无标可依的现状，为海洋资源调查提供重要的遗传学数据，为摸清我省的海洋动物资源遗传多样性现状、客观评价海洋保护工作效果提供科学依据。对科学制定海洋生物保护策略、促进海洋强省建设具有重要的(一)标准编制原则本文件按照科学性、先进性、实用性、完整性、协调统一性原则编写，适用于海洋动物资源的遗传多样性监测。1、科学性原则本文件中遗传多样性研究对象为同一物种不同个体可遗传的变异。基于形态学、染色体、等位酶、基因等不同层次的遗传多样性研究各有适用的检测和量化的科学方法，因此海洋动物遗传多样性监测具有坚实的科学理论基础和成熟的技术支持。遗传多样性监测程序按照实际需要确立；选择进化速度快的线粒体高变区设计筛选高特异性引物；样品采集要求保证样品的代表性，样品保存与运输有利于遗传物质保存完好；样品检测和数据分析均有大量的研究成果支持。形态学水平、细胞水平、染色体水平、生化水平、分子水平遗传多样性检测方法各有利弊。鉴于现代分子生物学研究技术的迅速发展，选择分子生物学方法用于遗传多样性进行分析，且以进化速度快的线粒体DNA(mtDNA)部分序列为目标，选择具有密度高、代表性强、遗传稳定、易自动化分析特点的单核苷酸多态性(SNP)分子标记进行遗传3、实用性原则由于自然条件下海洋动物资源的遗传多样性变化缓慢，监测周期5~10年。根据调查需求可选择现场调查采样，也可从调查海域捕捞作业船、渔港或市场直接采集来自目标海域的新鲜渔获物。在充分考虑科学性的同时，做到经济、合理、实用，可操作性强，便于贯彻实施。广泛开展了调查研究和必要的试验验证工作，全面掌握引物选择、样品采集、保存和运输、样品检测中影响监测结果的因素，并做出明确要求，标准内容完整、翔实。密切结合海洋生物资源遗传多样性监测实际情况，遵循国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准，参考行业标准，充分考虑国际上通用标准。在格式上按照GB/T1.1-2020和GB/T20001.6-2017的规定进行编写，编制说明按山东省市场监督管理局《山东省地方标准管理办法》第三章第二十一条和山东省市场监督管理局《关于加强地方标准管理有关事项的通知》附件要求编写。标准的文字表达力求准确、简明、易懂，结构合理、层次分明、逻辑严谨。标准中的术语、符号统一，与相关标准相协调。(二)主要技术内容和确定依据本标准从规范海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测方法、提供高效实用的检测技术和可比性强的监测数据的指导思想出发，主要对海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序、监测方案设计、样品采集、样品保存与运输、样品检测、质量控制、数据分析和监测报告等进行规定。同时参考国内现行相关标准，对主要技术指标进行试验验证后形成了标准的征求意见稿。1、术语和定义遗传多样性有广义和狭义之分。广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。本文中遗传多样性为狭义遗传多样性，是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和，引自《生物多样性研究的原理和方法》。为方便标准使用，对遗传多样性术语进行定义。2、遗传多样性标记的选择遗传多样性分析分为形态学水平、细胞水平、染色体水平、生化水平、分子水平等，不同水平的研究各有适用的检测的方法，且各种方法各有利弊。形态学和细胞学方法能快速地大致了解遗传变异大小；等位酶分析在技术上比较成熟，且能从分子水平上对基因组遗传变异的大小进行较为客观的度量；DNA分析近年来迅速，应用潜力很大，是未来发展的方向，因此本标准选择DNA水平对遗传多样性进行分析。扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简性(SNP)等分子标记在物种遗传多样性分析中得到了广泛的应用。其中，ISSR以锚定的微卫星DNA为引物来扩增简单重复区域间的序列，具有容易操作，可重复和稳定性及多态性检出高等优点，已用于多种海洋物种遗传多样性分析(李建辉，2000;AmitKumaretal,2014;PheravutWongsawad,2015)。SSR标记的数量丰富，具有较多的等位性变异、是共显性标记、引物的通用性好、所需模板少、试验重复性好、结果可靠等特点，在遗传多样性的分析中应用十分广泛。单核苷酸多态性标记(SingleNucleotidePolymorphism,SNP),是指生物基即在基因组的特定核苷酸位置上存在2个不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1%。从理论上说，SNP是目前覆盖了基因组所有DNA多态的唯一标记方法。由于SNP具有密度高、富有代表性、遗传稳定性、易实现分析的自动化的特点，在遗传多样性研究方面应用越线粒体DNA(mtDNA)是一种共价闭合、环状的双链DNA分子，具有结构简单、无重组、多数母性遗传、进化速度快、核苷酸替代率高、不同的区域进化速度存在差异，允许选择不同的区域进行不同时间尺度的进化分析等特点，已成为种类鉴别、群体遗传学以及系统发育等研究的有效遗传标记。2003年，Herbet等人提出以COI基因作为标准目标区域对所有物种进行DNA编码，现已进行大量工作，充分证明COI基因用于物种鉴定，物种分类，遗传多样性分析、物种进化分析的可行性，有效性和准确性。基于COI基因的SNP已用于多种海洋的一段非编码区，进化速度相对较快，是线粒体DNA序列和长度变异最大的区域，适用于群体水平的遗传多样性分析，目前已经被广泛应用于多种生物的多样性分析。农业行业标准NY/T1898-2010畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程中亦采用了D-loop分子标记。王锦锦等(2020)分别用COI、16SrDNA、D-loop序列研究了采集自中国青岛、烟台、俄罗斯符拉迪沃斯托克、韩国浦项、韩国木浦和韩国群山共6个海域8个不同地理群体刺参，发现D-loop和COI序列的多态位点数、单倍型数和核苷酸多样性均显著高于16SrDNA序列，更适用于同一物种不同群体遗传结构的解析。沈朕等(2017)利用Cytb、D-loop部分序列研究大泷六线鱼舟山、大连、琅琊台、即墨4个群体的遗传多样性，认为Cytb、D-loop均可作为检测大泷六线鱼遗传多样性的有效标记；杜景豪等(2020)用Cytb、D-loop序列对浙江舟山、福建福州、福建厦门、广西北海和广东湛江5个近海水域的日本囊对虾进行分析，认为5个日本囊对虾群体区域分化较为明显，具有较高的遗传多样性，呈现出较高的单倍型和核苷酸多态性；袁吉贵等基于D-loop和Cytb部分序列对东山岛和泉州市养殖场大海马进行了遗传变异分析，发现D-loop序列比Cytb序列敏感，两种分子标记均显示大海马群体中变异较小，在一定程度上反映了大海马资源稀缺的现象；孔杰等(2020)用Cytb、D-loop序列评估施氏鲟和西伯利亚鲟后备亲鱼群体的遗传多样性，认为西伯利亚鲟和施氏鲟亲鱼群体的遗传多样性匮乏，尤其在利用西伯利亚鲟亲鱼进行繁殖育苗时要注意近交的不利影响。COI、16SrDNA、Cytb、D-loop等线粒体DNA序列都被用于不同生物的种内遗传多样性研究。研究结果表明，D-loop序列适合用于多种生物的种内遗传多样性分析，与其他分子标记比较，具有更高的灵敏性。本规程选择利用PCR技术、DNA测序技术和生物信息学分析技术，对海洋动物线粒体DNA中进化速度最快的部分序列，通常采用线粒体控制区(D-loop)序列，缺乏D-loop序列的物种可采用细胞色素b (Cytb)、细胞色素氧化酶I(COI)基因或其他基因序列，进行单核苷酸多态性分析，获得群体的遗传多样性数据。根据监测需要确立监测程序，主要包括监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、数据分析、监测报告等。4、监测方案设计明确监测海域、监测周期、监测时间、样品采集、保存和运输、样品检测方法、监测指标、质量控制、数据分析、监测报告等。为确定野生海洋动物资源的监测周期，利用D-loop部分序列分别对2012年和2018年威海小石岛海域刺参遗传多样性进行分析，Hd分别为0.995和0.993,Pi分别为0.039和0.037,显示该海域刺参遗传多利用D-loop部分序列对2012年和2021年我省海域中国对虾、三疣梭子蟹遗传多样性分析发现，近十年来2个物种Hd和Pi值均有小幅度的下降(图1),山东海域三疣梭子蟹遗传多样性丰富，中国对虾单倍型多样度Hd多态位点比例%■2012年■2021年■2012年■2021年■2012年■2021年用COI序列分别对2012年和2016年莱州湾单环刺螠遗传多样性进行分析，Hd分别为0.600、0.951,Pi分别为0.01223、0.00835,显示莱州湾海域单环刺螠遗传多样性一直比较丰富，但2016年比2012可见自然条件下海洋动物资源的线粒体DNA遗传多样性变化较慢，因此对调查海域海洋动物的遗传多样性监测，每个物种每5年~10年开展1次即可。由于人工繁育海洋动物的遗传多样性状况参差不齐，大规模的增殖放流活动可能导致海洋动物资源遗传多样性的快速变化，因此建议增殖物种遗传多样性每年开展1次。5、样品采集与保存、运输遗传多样性样品可通过现场调查采集，也可从监测海域捕捞作业船、渔港或市场直接采集新鲜的渔获物。其中，现场调查采集按计划在调查海域设置多个站位，站位布设按GB/T12763.6规定执行。对海洋底栖生物、潮间带生物进行定点采样，对移动迅速的底栖生物可设地笼诱捕。对游泳能力强的鱼类、甲壳类等进行拖网采样。对非现场调查采样，按GB/T18654.2规定的方法从监测海域捕捞作业船、渔港或市场直接采集渔获物。采样数量及方法要求，按形态学分类后，依据GB/T18654.2规定采集同一物种30个以上独立个体作为一批样品。采样通常采取海洋动物整体；对大型海洋动物实行部分采样；对海洋保护动物、珍稀濒危生物实行非致死性采样。部分采样和非致死性采样要提前准备专业采样工具，由经培训的专业人员操作。对大型海洋动物实行部分采样，无菌操作采取肌肉组织约0.5g;对海洋保护动物、珍稀濒危生物实行非致死性采样：视监测生物的具体情况，无菌操作剪取部分鱼类鳍条组织约100mg,或用无菌注射器于尾静脉处抽取血液约0.5mL;贝类无菌取小部分外套膜组织；蟹类用无菌注射器从第3步足基节关节膜处刺入抽取血淋巴0.1mL。样品保存和运输过程中要尽量保证每个样本的DNA不被污染和降解。因此要求：整体采样的个体应保持完整；部分采样的组织应每个个体独立包装。采样后立即冷冻或4℃~10℃冷藏，冷藏时间应不超过24h,长时间保存应-20℃以下冷冻，样品运输过程中应保证温度在10℃以下。体积小于1cm³的样品或组织，可量取10倍以上体积的乙醇(95%以上)或商品化的样品保存溶液加入，常温保存与运输。7、采样记录采样的同时填写表A.1采样记录表，详细填写样品的名称、编号、来源、数量、保存条件、状态、采样人员及时间等信息，以保证样品的来源清楚、质量符合检测要求。8、样品检测8.1DNA提取DNA可用常规酚-氯仿方法提取，也可选用商品化的DNA提取试剂盒。海洋动物取肌肉或鳍条组织约100mg,液氮冷冻研磨、组织匀血液样品用血液DNA提取试剂盒提取总DNA。用试剂盒提取DNA,操作步骤按说明书进行；酚-氯仿方法提取DNA的步骤见附录B。提取的DNA用洗脱液或灭菌双蒸水溶解，取5μL用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，电泳方法参照附录C。或取适量DNA溶液用核酸定量分析仪测定A260/A280比值和DNA浓度。经检测DNA质量良引物宜引用已公开发表学术论文或研究报告，或在基因数据库中搜索目标物种的线粒体DNA序列自行设计2对~3对，引物宜符合Tm值50℃~60℃、长度18bp~24bp、G+C含量在40%~60%、PCR产物长度400bp~600bp。为避免设计的引物个别碱基误差，引物序列通过DNA序列比对工具与目的序列比对验证，检查校正无误后合成。用合成的引物对样品进行预实验。按每对引物的Tm值设定退火温度，进行PCR。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，选择PCR产物条带单一、清晰、且长度与预期一致的引物，进行双向测序。PCR产物能够成功测序的引物作为该物种的遗传多样性监测引物。条引物的Tm值不同，影响-PCR的退火温度；PCR产物的长度决定延伸时间，因此规定PCR反应程序：94℃变性3min;94℃变性30s,X℃退火30s(其中X视不同引物的具体Tm值确定),72℃延伸30~60s,35个循环；72℃延伸10min,4℃保温。8.5PCR产物回收、纯化与序列测定对所有样品进行扩增后，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段，交由生物科技公司测序。或PCR产物直接双向测序。因PCR方法十分灵敏，为确认检测过程中是否存在试剂污染、交叉污染、扩增失败等现象，要求每批样品PCR同时，用灭菌双蒸水、其他物种DNA和检测物种DNA分别作为空白对照、阴性对照和阳性对照。电泳时每排样品至少加一个DNA分子量梯度标准做参照，以判断扩增产物的分子量，初步确认实验质量。琼脂糖凝胶电泳结果显示空白对照、阴性对照无特征性条带，阳性对照出现特征性条带，且检测样品出现和阳性对照相同的特征性条带，检测样品PCR产物可进行测序。遗传距离是指不同的个体或种群之间的基因差异的程度；单倍体多样性是指样本中随机抽取到两个不同单倍型的频率；平均核苷酸变异数是指所有个体的核苷酸变异数之和与个体数的比值；核苷酸多样性是指平均核苷酸差异数与序列长度的比值。这几个参数目前常用于对生物遗传多样性评价和分析。DNA测序结果用生物软件进行比对、剪切，用最大合成似然法 构建系统发育树。DNA序列多态性分析，计算单倍体多样性、平均核苷酸变异数、核苷酸多样性等遗传多样性数据。分析结果填写表F.1检11、D-loop序列在遗传多样性分析中的应用实验以三疣梭子实验所用样品于2021年9月采自山东省海域。拖网采集后的样品粒体DNA序列(登录号：NC_005037.1),用primerpremier6.0软件设计D-loop区序列引物3对，引物由华大基因合成，预实验后选择特异性强、扩增条带长度适中的引物作为本研究用引物：总DNA提取、PCR扩增及序列测定均按标准规定执行。琼脂糖凝胶电泳结果显示，三疣梭子蟹PCR产物为一条600bp左右主带(图2)。切胶回收后交给华大基因测序，其中38个个体获得满意结果(图图3三疣梭子蟹PCR产物双向测序峰值图用MEGA4.0软件对所有测序结果进行比对，剪切去除引物序列获得581bp序列用于下一步分析，其单倍型I的DNA序列见表1。表1三疣梭子蟹单倍型IDNA序列表ACTCTCATACAAACTTAATATAAACGCAAGGAATTAAGAAACAATCAAACTAACCCGTCAAGCGAGTATAAAATAAAGGCCTACATACAAAGAGCAACTATAAAATATAAAGGTCTTATATCTCATTCTTCACTTAGTGAAGAGTTCAAACCAATATTATATTATTTATACTCCTACATTAAGACAGCAATTAGATAGTTACTAT360CTAATCATCTTTAATAATATTTGCTCTAAATAGAGAGATGAAGAAGGAAGTGAGTTCATGTTCTCGAGAGGTTCACTTTCTTC580MEGA4.0软件分析结果显示，本实验所用的581bpD-loop序列 (不包括引物)中，T、C、A、G碱基的平均含量分别为35.0%、16.0%、38.7%、10.3%其中A+T、G+C的平均含量是73.7%、26.3%,AT含量明显高于GC含量，显示该片段为富含AT的区域。在所分析的38个三疣梭子蟹样品中，群体内个体间遗传距离为0～0.035,群体内平均遗传距离为0.016(表2)。46784k000bDnaSP5.0软件分析结果表明，581bp共包含单态位点ormissingdata)8个，多态位点数(Invariablesites)58个，其中单一多态位点(Singletonvariablesites)23个，简约信息位点38个样品共定义了25个单倍型，单倍型多样度(Hd)为酸差异的平均数k=9.243。显示黄渤海三疣梭子蟹遗传多样性较用MEGA4.0软件分析2021年黄渤海采集的三疣梭子蟹样品38个、2020年采集的样品2个和NCBIGenbank中1个(登录号(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树(图4),进行亲缘关系图4三疣梭子蟹D-loop序列NJ树由图4可知，所分析的41个样品主要分为3支，不同站位所采集样品聚类没有规律，未发现有地域特异性。总体遗