HIV-1病毒载量测定及质量保证指南

HIV-1HIV-1病毒载量测定及质量保证指南#HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（2013版）GuidelineforHIV-1ViralLoadTestingandQualityAssurance中国疾病预防控制中心2013年1月前言随着HIV-1病毒载量检测在艾滋病临床辅助诊断、抗病毒治疗监测及相关科研工作中的广泛应用，我国开展该项检测工作的实验室日益增多。自1997年艾滋病实验室首次引进HIV-1病毒载量检测技术以来，截至2012年底全国已经配备115台HIV-1病毒载量检测仪，覆盖疾控、医院、检疫、军队等系统，艾滋病流行重点地区及少数县级实验室均已配备HIV-1病毒载量检测仪，每年检测量已达13万人份以上。由于HIV-1病毒载量检测质量对艾滋病的早期诊断及治疗有重要影响，因此急需加强该领域的培训和质量控制，规范实验室操作，以保证检测结果的准确性和可靠性。自2008年开始实施《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》（试行，以下简称《指南》）以来，参与HIV-1病毒载量能力验证工作的实验室从2007年的29家增加到2012年的107家，占已开展工作实验室的百分之九十以上。通过综合分析近几年能力验证发现的问题与检测技术发展的实际情况，考虑各种试剂的检测要求，结合专家意见和一线实验室工作人员的经验与需求，对本指南进行了适当修改、调整和补充，主要修改内容包括：（1）增加“人员要求”章节；（2）修改“常用HIV-1病毒载量检测方法”；（3）修改“HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）”；（4）补充常见问题分析和处理等内容。修订后的《指南》共分八章，包括：总则，人员要求，实验室环境与设施，样品的采集、处理保存运输，常用检测方法简介，室内质量控制，实验室检测能力验证（PT），实验室生物安全，以及四个附表。本指南在修改过程中，接纳了国内专家、同行的意见和建议，经过多次修改编写成《指南》（2013）版。本指南由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心艾滋病参比实验室组织有关专家撰写，由中国疾病预防控制中心批准执行，并在HIV-1病毒载量检测实验室网络内发布实施。由于国内各实验室条件不同，不能采纳所有实验室的建议，因此本指南主要提出一些原则上的参考建议，其中定有不妥之处，希望广大同仁提出意见，以便不断完善。本指南在2008年颁布的《指南》（试行）的基础上修订，在此对编写试行版过程中给予帮助的国际组织和专家表示感谢。对本次修订过程中提出建议的全国HIV-1病毒载量检测实验室基层工作人员表示衷心的感谢。本指南的解释权属于中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。本指南编写主持人：蒋岩本指南编写人员：潘品良蒋岩李敬云钟平尚红李太生李繁本指南审核咨询专家及技术人员：邵一鸣汪宁王佑春郭志宏肖瑶邱茂锋邢文革姚均朱红秦光明徐建青本指南编写联系人：潘品良本指南适用于全国HIV-1病毒载量检测实验室本指南编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心本指南自发布之日实施，同时终止2008年颁布的《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》（试行）。HIV-1病毒载量测定及质量保证指南目录第一章总则第二章人员要求第三章实验室环境与设施第四章样品的采集、处理、保存、运输第五章常用检测方法简介第六章室内质量控制第七章实验室检测能力验证（PT）第八章实验室生物安全附表1常见问题分析和处理附表2HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单附表3HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单附表4HIV-1病毒载量检测报告单参考文献缩略语第一章总则意义HIV-1病毒载量是指每毫升血浆中病毒颗粒的数量，是艾滋病防治工作中一项重要的实验室检测指标。HIV-1病毒载量检测主要用于抗病毒治疗监测，包括治疗时机判定、治疗效果评估、耐药预警；还可用于HIV感染的辅助诊断，包括窗口期、病程晚期、婴儿感染、疑难样本等的诊断；也可用于血液筛查。为了保证检测结果的准确性和可靠性，必须对开展HIV-1病毒载量检测的实验室进行规范化管理和质量控制。目的指导HIV-1病毒载量检测工作，规范实验室质量控制与管理。适用范围适用于我国开展HIV-1病毒载量检测工作的所有实验室。第二章人员要求HIV-1病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。培训实验室在使用新方法前，须对技术人员进行上岗培训，获得资格后方可开展相应工作。上岗培训内容至少应包括：HIV检测相关基础知识，HIV-1病毒载量检测技术及管理要求，实验操作，质量保证与质量控制，生物安全。检验人进行HIV-1病毒载量检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，接受过省级以上的实验操作技术及艾滋病实验室生物安全培训及厂家的技术操作培训。所有相关检验人员需经公司工程师操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持证上岗。复核人、签发人应具备对检测过程进行分析、解决问题的能力。复核人负责对原始数据查阅、结果核对，签发人核实结果正确后对外签发报告。第三章实验室环境与设施除了HIV-1病毒载量检测仪器，合理地、充分地配备实验室环境、设施、辅助设备是保证HIV-1病毒载量检测质量的重要方面。实验室环境HIV-1病毒载量实验室应符合分子生物学实验室基本要求，包括试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区。实验室设置总体原则为各区独立、控制风向、因地制宜、方便工作。具体要求：各区必须是相互独立的，有条件各区内可分别设置缓冲间，以保证不同区之间完全分隔开。各区的仪器设备与各种物品必须为专用，避免交叉污染。试剂准备区和样品处理区内须保持低度正压（或常压）状态，使空气流向始终由室内向外，以避免扩增污染物进入此区域。扩增产物分析区内须保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向内，以防止扩增产物通过气溶胶流出，造成与其他区域的交叉污染。实验室可安装排风扇或其他排风装置。扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。工作时必须遵循单一工作流向，即只能从试剂准备区开始，到样品处理区，然后到扩增产物分析区。实验室设施各种HIV-1病毒载量检测方法除病毒载量检测仪外，还需要配备相应的辅助设备才能完成检测。HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图提供为HIV-1病毒载量检测实验室不同区内必备的辅助设备及耗材。辅助设备应根据不同检测方法作相应变化。样品处理区：生物安全柜：二级离心机（32000g，适合1.5mL离心管）冰箱：2-8℃，-20℃，-70℃以下水浴箱：误差范围小于0.5℃加样器1套（20μL、200μL、1000μL）

带滤芯的一次性吸头（无DNA和RNA酶），1.5mL离心管（无DNA和RNA酶）及相应试管架计时器旋涡振荡器：震动频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图病毒载量仪

加样器生物安全柜

加样器超净工作台

加样器带滤芯的一次性吸头（无DNA和RNA酶），1.5mL离心管（无DNA和RNA酶）及相应试管架计时器旋涡振荡器：震动频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套HIV-1病毒载量检测实验室设备分布示意图病毒载量仪

加样器生物安全柜

加样器超净工作台

加样器扩增产物分析区漩涡振荡器漩涡振

荡器冰

箱2-8℃样品处理区注:箭头表示风的流动方向冰箱-70℃冰箱-20℃冰

箱2-8℃试剂准备区试剂准备区：超净工作台（或密闭工作台）加样器1套（20μL、200μL、1000μL）离心机（18000g，适合1.5mL离心管）冰箱：2-8℃，-20℃计时器旋涡振荡器，震动频率可调带滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）1.5mL离心管（无DNA和RNA酶）及相应试管架一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套扩增产物分析区：HIV-1病毒载量检测仪加样器1套（20μL、200μL、1000μL）冰箱：2-8℃，-20℃旋涡振荡器，震动频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套带滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）第四章样品的采集、处理、保存和运输样品的采集、处理、保存和运输要求保证满足不同HIV-1病毒载量检测方法对样品性质的，并保证生物安全。因此需按照所使用检测方法的要求严格执行抗凝、分样时间、运输包装、保存温度、冻融记录。用于HIV-1病毒载量检测的样品须采用抗凝血浆。样品的采集采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。抗凝剂：通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸橼酸钠），须符合不同检测方法对样品的要求。样品标识：在采血管上贴唯一性样品编号。样品采集量：通常采集全血8-10ml,采集的样品量应与定量采血管的刻度要求一致，避免血液凝固或稀释。样品混匀：采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管10次，使血液与抗凝剂充分混匀。其它信息：HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）的备注栏内需注明采集对象的基本信息和流行病学资料、抗病毒药物使用情况、最近一次的实验室病毒载量检测结果。样品的处理要求在采血后6小时内离心样品，室温下使用离心力为800-1200g（1500-3000rpm）离心10分钟后，吸出血浆,分装到无菌的聚丙烯螺口冻存管中，并注明分装时间，冻存管应提前贴上耐冻的样品编号标签。血浆样品不能灭活。做好样品处理记录，包括冰箱温度变化、样品存取。样品的保存保存条件：根据血浆检测时间而定，4天内可在4℃暂时保存，3个月内应冻存于-20℃以下，3个月以上应置于-70℃以下。不能使用自动除霜冰箱。血浆样品冻融不应超过3次。监控并记录保存温度以及样品状态的变化防止样品变质、泄漏及污染。样品的运输根据《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，避免样品融化。样品的发送和接收发送样品时,需详细填写样品HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）。接收样品时，按HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单（附表2）核对样品数量，检查样品状况。样品管破损造成样品溢出、出现明显溶血、凝血的样品，不宜作HIV-1病毒载量检测；如果样品已经融化，可以4℃保存并尽快检测，记录冻融一次。第五章常用检测方法简介HIV-1病毒载量检测根据方法的原理不同，分为不同系列仪器，目前常用的HIV病毒载量的测定方法有：核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术，代表产品为实时荧光技术NucliSensEasyQ仪；分枝DNA信号放大系统(bDNA)技术，代表产品为bDNA440分析仪；实时荧光定量PCR扩增技术(real-timePCR)，包括CobasAmplicorTaqman检测系统、M2000检测仪与国产试剂盒均属此类技术。5．1核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术最早产品为NucliSensECL定量RNA测定方法，已经被NucliSensEasyQ新一代实时分子信标定量扩增所取代。所采用的 NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶 AMV-RT和T7-DNA多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。NuclisensEasyQ结合NASBA技术、BOOM核酸提纯技术与分子信标探针技术(MolecularBeacon)检测血浆中的HIVRNA水平。这种结合方法使用实时扩增分析(real-timeamplificationassay)，提高对诊断质量的要求。此方法可分为三个步骤：核酸提取、扩增和等温检测。NucliSensEasyQHIV-1的检测是利用靶特异的分子信标进行，分子信标的DNA寡核苷酸片段包含一段可特异结合靶RNA的序列。当RNA互补链不存在时，分子信标维持内部发夹结构，使猝灭基团处于非常接近荧光素的位置，荧光信号被猝灭。当分子信标与互补靶序列结合，发夹打开释放荧光信号，报告靶序列的存在。NucliSensEasyQHIV-1使用两个不同的分子信标，一个是针对野毒株HIV-1RNA的扩增子，另一个针对内标物RNA(calibrator)的扩增子，各使用不同荧光染料(野毒株使用6-FAM，内标物使用6-ROX)，从而实现靶序列和内标物RNA两个扩增过程的各自跟踪。荧光信号的动力学分析可以显示野毒株和内标物RNA的转录速率，因此可以计算出原样本中HIV-1RNA含量。5．2分枝DNA(bDNA)技术分枝DNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即分枝DNA信号放大系统，为一个人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应。方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定待检样品的病毒拷贝数。bDNA检测通常包括以下步骤：（1）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核苷酸靶探针的裂解液加到微孔中；（2）孵育，释放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA变性,然后靶探针结合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷却洗板；（4）加信号放大探针（bDNA）到各孔内；（5）孵育，使bDNA杂交到靶探针的相应部位；（6）冷却洗板；（7）加标记探针到各孔内；（8）孵育，使酶标记的探针杂交到bDNA上；（9）冷却洗板；（10）加化学发光底物到各孔中；（11）孵育，酶和底物相互作用，产生化学发光信号。发射的光强以相对光量值（RLUs）表示。产生的光强直接与各样品中病毒RNA或DNA的拷贝数成正比。各样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。bDNA440病毒载量检测仪较bDNA340在孵育、冲洗和加样步骤由手动操作转变为自动化，减少污染，更便于操作节省实验时间。5．3实时（real-time）荧光定量PCR扩增实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR扩增的实验检测过程可分为：（1）样品制备,抽提和浓缩目标RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-timePCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。检测的原理基于荧光信号增长曲线与循环数相关。（3）RT-PCR反应，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后通过DNA聚合酶对特定片段进行扩增。（4）扩增产物的检测，基于检测阈值的设定，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品病毒载量成线性关系。利用标准品制作循环数与病毒载量的标准曲线就能对样品病毒载量进行定量检测。目前此原理已为多种HIV-1病毒载量检测的的主要方法，包括CobasAmplicorTaqman检测系统、M2000检测仪和国内产品凯杰、达安以及正研制的定量检测试剂均属于该技术。CobasAmplicorTaqman检测系统是全自动化的实时荧光定量PCR病毒载量平台,具有样品进--结果出(sample-in,result-out) 的特点。此方法的检测过程为：装待测样品、放试剂和耗材、 核酸提取、PCR反应体系制备、实时荧光定量PCR。Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。M2000利用RT-PCR法，在开始制备样本时，对每个样本加入与HIV-1目标序列无关的RNA序列。这种不相关的RNA序列通过RT-PCR被同时扩增，从而充当内部质控品(IC)。在m2000rt仪器上，每个扩增循环中存在的HIV-1目标序列总量通过含荧光标记的寡核苷酸探针测定。m2000rt系统通过样品制备、试剂制备和反应板装置、扩增、检测四个步骤，检测到荧光信号的扩增循环与初始样本中存在的HIV-1RNA浓度对数成比例。国内产品匹基、达安试剂盒的原理步骤与上述类似，为开放式试剂，可以使用多款实时荧光定量PCR检测仪。5．4不同方法检测结果间相互关系病毒载量的检测单位有拷贝数(CP)/ml和国际单位(IU)/ml，且同一样本不同方法的病毒载量检测结果不同，另外，不同方法间检测结果并无固定的转换关系，与病毒亚型、试剂不同版本有关，因此评估同一病人的治疗效果需用同一种方法检测，并且考虑试剂版本的更新情况。第六章室内质量控制内部质量控制是在良好实验室整体环境支持下，从样品接收到发出报告整个过程每个环节的管理过程，包括：（1）人员；（2）实验室分区和环境；（3）仪器；（4）检测过程（试剂、操作过程、质控品使用）；（5）数据报告。人员HIV-1病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。所有相关检验人员需经操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持证上岗。复核人、签发人应具备对检测过程进行分析、解决问题的能力。实验室分区和环境实验室分区的功能HIV-1病毒载量检测实验室原则上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。不同检测方法的分区功能和要求可有所不同。试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存；样品处理区：样品登记、分装，核酸提取、保存和加样；扩增产物分析区：产物扩增的测定、结果分析、登记及报告。严格要求三区的单一空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。实验室的设置及辅助设备的具体要求参见第三章。实验室环境的要求实验室有足够的空间；采光好，应避免阳光直射设备；室温控制在18~25℃；室内相对湿度控制在30~70%；电源稳定，HIV-1病毒载量检测仪应配备稳压电源；室内保持干净整洁，无灰尘；实验前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸钠及时处理操作台面。仪器设备质控加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次，每半年期间核查一次。HIV-1病毒载量检测仪及其配套仪器可以委托公司校准，每年一次。离心机可以委托计量部门或公司校准，每年一次。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，每次做好记录。检测过程质控试剂质控使用经国家食品药品监督管理局注册的试剂。所有试剂盒须严格按要求条件保存。试剂盒拆封时，要记录拆封时间，所有试剂严格控制在有效期内使用。实验用水：要求使用无DNA和RNA酶的去离子水。操作过程质控按照试剂盒要求与实验室的条件及时更新标准操作程序（SOP），并严格执行，不得擅自修改。质控品的使用每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的质控品，并满足质控要求。同时使用外部质控品（HIV病毒载量值为5000-15000拷贝/毫升质控品），如果试剂盒没有阴性质控品，需加一个阴性质控品。外部质控品的制备、定值及使用（1）制备对用于制备质控品的大样本血浆样品，要求用EDTA抗凝剂抗凝，新鲜抗凝血离心分离，得到透亮血浆。然后用孔径为0.2微米的滤膜过滤除菌，充分混匀。按各自方法对样品量的需求，用无菌冻存管定量分装，标记，封口，冻存于-70℃以下非自动除霜冰箱内，避免反复冻融。按实际使用量的要求配制足够量外部质控品（推荐每次配置量可使用两年）。（2）定值从制备好的外部质控品中随机选出5管，严格按照实验室的各自方法标准操作程序进行HIV-1病毒载量检测，将测得结果的拷贝值或IU值换算成Log10值，计算其算术平均值（M）和标准偏差（S）。（3）质控图的绘制和使用根据测得值，在坐标图上画出平均值、±2S、±3S线图，作质控图使用。每次检测都应带一个外部对照，将得到的外部质控品Log10值标在上述质控图上。每次质控品测得值在平均值±2.0s内方为有效。使用新批次的外部对照质控品时，必须重新绘制质控图。（4）质控品不宜使用稀释方法制备。6.5数据分析、结果报告在试剂盒及外部质控品结果满足要求的前提下，对样品进行分析。外部质控品不合格，样品需要重新检测。结果超过检测上限的样品应稀释以后重新检测。复核人对检测结果进行仔细复核并对结果提出结论、签字。签发人对结果的结论进行审核、分析、总结、签字。按不同方法的要求，以拷贝/毫升或国际单位/毫升为单位报告样品的HIV-1病毒载量值。第七章实验室检测能力验证（PT）HIV-1病毒载量检测的外部质量控制可以通过参加外部质量评价，提高实验结果的可比性，发现系统误差，改进实验室工作，提高检测质量。HIV-1病毒载量检测实验室须参加艾滋病/丙肝参比实验室或有资质的国内外机构组织的HIV-1病毒载量检测能力验证来实施外部质量控制。PT组织艾滋病/丙肝参比实验室为HIV-1病毒载量检测能力验证（PT）的组织者，负责制定国内HIV-1病毒载量检测能力验证的计划并组织实施。国内所有从事HIV-1病毒载量检测的实验室须参加该PT项目，在规定时间内使用有效试剂与实验样品一起检测，填写HIV-1病毒载量检测报告单（附表4），上报艾滋病/丙肝参比实验室。鼓励有条件的实验室参加有资质的国内外机构组织的PT活动。PT实施PT样品组成：每次5份。包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。可以根据实验室的考核目的制备考核盘。PT频率：一年2次。PT样品的接收与保存：要求参加PT的实验室收到考核样品后，立即进行核对、检查，填写HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单（附表3），3天内传回艾滋病/丙肝参比实验室。如发现考核样品缺失、量不足、空管等情况，及时书面回报，艾滋病/丙肝参比实验室负责补寄或更换。收到样品后应及时检测或在-70度以下保存。PT样品的检测：要求将考核样品同实验室常规样品一起检测，由常规检测人员进行。PT结果的报告和处理：参加PT的实验室必须在规定的时间内，用电子邮件或书面报告实验结果，并将HIV-1病毒载量实验结果报告单和打印的仪器原始记录一起上报给艾滋病/丙肝参比实验室，艾滋病/丙肝参比实验室将负责结果录入和处理。有任何原因不能按时上报者，需有单位盖章的书面申请。评分原则将参与实验室反馈结果换算成对数值（Lg），再按同一种方法与同一个考核品的的所有实验室结果进行统计，算出平均值（M）和标准偏差（S）。成绩判定：根据每个参与考核实验室一年两次所有考核品的结果进行综合评分（每一个考核品的评判标准依照与条款），判定标准为：优秀：所有考核品没有问题；良好：有一个考核品满足中的条款；合格：两个考核品满足中的条款④不合格：至少有三个考核品满足中的条款或至少一个考核品出现中的条款。样品结果在M+2.0S～M+3.0S内；样品结果在M-2.0S～M-3.0S内；考核结果报告没及时上报；没按要求上报原始记录。样品结果超过>M+3.0S；样品结果<M-3.0S；假阳性；假阴性；无效结果。评估结果反馈：艾滋病/丙肝参比实验室根据各实验室的两次考核结果，及时反馈每次评估结果。每年反馈最后的评估结果，并发证书。抱怨和申诉：参评实验室如对评估结果或其它方面存有异议，可以在收到结果后10天内向艾滋病/丙肝参比实验室提出异议，后者在核实情况后予以答复。现场督导：根据考核情况的需要，艾滋病/丙肝参比实验室组成技术专家组对不合格实验室进行现场检查。检查内容包括：实验原始数据、实验室布局、仪器运行状况、辅助设备校准状况、实验耗材质量、样品保存、试剂盒使用状态、人员培训状况、质量保证和质量控制等。给实验室反馈督导报告，现场实验室按相关建议作出整顿。第八章实验室生物安全相关依据《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样品运输管理规定》、《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》和《全国艾滋病检测技术规范》。安全细则进入实验室应穿工作服、戴口罩、戴一次性乳胶手套。严禁在实验室内进食、饮水和吸烟以及使用化妆品。所有样品包括试剂盒中的人源性成份（如阴、阳性对照）都应在生物安全柜内进行处理。样品应盛装在有螺旋盖的离心管中，以防样品溅出或产生交叉污染。当具有潜在传染性的物质溢出时，立即用0.1%次氯酸钠溶液或其它消毒剂处理污染区及器材；接触过标本的耗材应置有专用消毒剂的容器，与一次性物品一起在丢弃前进行高压灭菌处理。避免试剂盒中各种有毒有害化学成分（如叠氮钠、二甲基亚砜、异硫氰酸胍）对人体或环境可能造成的危害。8.3生物安全培训所有涉及HIV-1病毒载量检测的人员都应经过严格的安全培训，要掌握生物安全保障的原则、措施。每个人的安全教育均应记录在实验室和人事档案中。省级及以上疾控中心艾滋病实验室负责HIV/AIDS检测生物安全培训及HIV-1病毒载量检测培训。检测相关人员应主动接受实验室生物安全员以及安全负责人的监督。所有实验室意外事件均应进行记录和报告。所有人员要保护自身和环境的安全。参照实验室安全指南和标准操作程序的有关规定执行具体操作。职业暴露处理实验室应建立完善的艾滋病职业暴露后的预防机制。发生职业暴露后，首先进行应急处理，然后根据暴露级别和暴露源头严重程度，评估风险级别，并决定是否进行预防性用药和用药程序，如需要时，尽早开始服用抗病毒药物。按规定进行职业暴露登记、检测和报告，注意做好保密工作。

附表1常见问题分析一）EasyQ问题（出现错误代码）处理方法错误代码1：未检测到信标严格按标准操作步骤执行（如样本裂解、酶溶解要充分）错误代码2：内标数据与野生型数据不符由公司工程师解决软件收集数据出错误代码3：曲线中断使用稳压电压错误代码4：无扩增a、标本中有严重的溶血、脂血和纤维蛋白或一些未知的抑制因子,浑浊标本，检测前离心样品2000g，5-6分钟。b、充分裂解样品。c、充分溶解内标。d、加硅胶后，立即震荡混合。e、清洗过程中要洗干净裂解液或洗液，管壁上有残留的裂解液或洗液1。g、洗脱后立即将核酸和硅胶分离。（核酸又被硅胶吸附）h、转移核酸时避免吸入硅胶。i、充分溶解引物，立即振荡溶解。j、充分溶解酶。放置时间要大于15分钟。复溶时需在室温下进行。k、用准确的微量加样器加入足量引物。l、排除排管底部的气泡，排管放到孵育器上时需压紧。m、充分振荡排管，完全混匀反应体系液体。n、密封保存排管、离心管等耗材。o、控制环境中的抑制物污染。p、温度需降至41℃时即将酶溶液混入反应排管。错误代码5：弱扩增曲线平缓，操作时温度控制稳定及混合充分错误代码6：计算错误检查电脑软件错误代码7：异常扩增正确加入核酸，保持电压稳定，严格控制引入抑制物。错误代码8：延迟时间过短加入酶后及时进行扩增，操作熟练。错误代码9：弱扩增常见错误，详见代码4。应注意操作细节避免错误发生。错误代码10：未检测到内标加入内标，减少标本量或者稀释样本

再进行检测。错误代码11：信息不全操作时注意事项参考4和9中细节避免错误发生。错误代码12：延迟时间过长导出结果，曲线截图，公司工程师解决。二）bDNA问题处理方法注射器含有气泡加适量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶内液面下。分析仪底部的加热托盘上有液体检查管路连接。管路有堵塞或细菌滋生每次实验后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空废液瓶；每周清洗洗液瓶,水瓶和废液瓶，管路系统。分析仪不能从孔内吸取足够的液体检查废液管连接头RLU值低确定按产品要求储存、配制试剂；环境温度在18-30℃；试剂盒没有过期；实验中所使用的试剂来自同一批次；每周清洗过程中在管道和试剂瓶中没有残留。RLU值高确定全使用干净的一次性无菌实验材料；使用防气溶胶的加样枪头；残留的底物没有倒回原瓶；用70%乙醇定期擦洗微量加样器；盛洗液的试剂瓶内有足够量的洗液；检查分液、吸液操作；每周进行保养；分析仓门关闭严实；检查背景RLU值。变异系数(CV)高确定微量加样器经校准；使用防气溶胶的枪头；枪头紧密套在加样器上；加试剂时枪头位置在孔的中部；样品凝块或残渣没有被吸取；样品加的位置与样品ID和DMS规定的位置一致；样品按产品说明收集,处理和储存；只使用干净的一次性无菌实验材料；检查分液吸液操作；盛洗液的试剂瓶内已装有足够量的洗液；每种试剂在实验开始前被轻轻混匀；每种试剂预热充分,以防有沉淀；封闭垫组装正确；孔内样液没有溅洒；分析仓门关闭严实；检查RLU背景。标准曲线平坦或不正常加标准时板的缺口在左边强或弱对照定量高确定各孔仔细加样,未触及邻孔；使用无菌枪头；封闭垫组装无误；加样器定期校准；使用防气溶胶的枪头；标准和对照加样位置正确；按产品说明要求储存,配制。强或弱对照定量低确定试剂盒在运输和到货后储存在正确的温度；使用无菌枪头；没有吸取气泡；封闭垫组装无误；加样器经校准；小心处理测试板,防止溅洒；标准和对

照加样位置正确；按产品说明要求储存,配制；样品,标准,对照在吸取前至少震荡5秒。打液不均匀排液残余量过多WA检查抽洗轴头是否堵塞，如果有堵塞，卸下后用注射器疏通。背景光路值大于或等于0.05IRL检查用于进行背景检查的白色间隔反应孔是否被污，检查光路读数头是否有破损漏光现象实验过程中一孔或者几个孔出现WA2435或者WA2437报警，但仪器没有停机，出现报警的孔没有实验结果。检查实验用水和次氯酸钠是否达标，水是否有污染，管路是否有堵塞或者漏气现象，反复清洗管路。检查抽洗轴头是否堵塞。仪器底部洗站周围出现水迹或者有明显漏水检查蠕动泵管是否有破裂或者安装错误，检查洗站和排液管连接是否有裂缝。实验过程中出现CL开头的错误代码检查板架四角磁铁是否有脱落现象，用AB胶粘好。实验完成后打开舱门，发现试剂仓中部有明显积水查看房间湿度是否低于60%，开除湿机除湿。打开仪器舱门，在仪器舱内部放少量固体干燥剂三）Taqman问题处理方法设备出现未预料的资源错误重新启动设备和AMPLILINK软件AMPLILINK软件出现数据库错误重新启动AMPLILINK软件热循环区域出现：TC温度同步化；TC盖同步化重新启动设备条码扫描机出现资源cmd为扫描机硬件错误，重新启动设备条码阅读机出现条码不可读条码松则采取条码复位；条码损坏则重新载入或生成新的序列/ID样本量不准确样本量不足0.970ml或超过1.030ml均不可检测

附表2HIV-1病毒载量检测样品送检/接收单送检单位送样人送检日期采样时间采样管抗凝剂运输保温方式姓名性别年龄现住址户籍所在地是否治疗是治疗号：否样品编号样品性质样品量（ml）备注接收单位接收人接收日期

附表3HIV-1病毒载量检测能力验证样品接收专用单实验室名称接收日期收到考核品量编号体积（ul）考核品状态外包装是否完整是否冰块是否融化是否样品是否融