七种观察方式

显微观察方式观察方式1.明场观察2.暗场观察(暗视野)3.相差观察4.偏光观察5.DIC观察(微分干预)6.RC观察(浮雕相衬)7.荧光观察(一)明场观察方式常规观察方式应用领域： 常规镜检、病理、染色标本优点： 视野亮度高、均匀， 应用范围广， 操作简单，价格低， 物镜适用于荧光观察缺点： 透明标本比照度低， 标本没有立体感(二)暗视野观察方式1原理丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。2特点观察到极其微小物体，分辨率可达0.02~0.004um(明场0.4um)—”超显微“。3缺点只能观察到物体存在、运动和外部形态不方便调节标本要求高〔灰尘、盖片、载片〕4应用：

微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察等(二)暗视野观察方式〔三〕相差观察方式1原理利用被检物体的光程〔折射率x厚度〕差进行镜检，即利用干预现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共轭面：吸收光线，直射光通过补偿面：相位推迟，衍射光通过物镜相板聚光镜环状光阑(三)相差观察方式2特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3缺点需要光强高切片不能太厚(5~10um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜(三)相差观察方式4应用：

无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,别离细胞)(三)相差观察方式5调节：苛勒照明调节将相差物镜及附件转入光路,对样品聚焦取下目镜，装上CT望远镜，调节焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合〔四〕偏光观察方式1原理依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜自然光〔多振动面〕偏振器1偏振器2偏振光〔单一振动面〕各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等〔四〕偏光观察方式应用：

矿物质、化学物品鉴别鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体植物病理检验鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等〔五〕微分干预〔DIC〕观察方法〔五〕微分干预观察方法1原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点〔小于显微镜的分辨率〕上通过被检物体，从而在相位上略有差异，使图象呈现出立体三维感觉。〔五〕微分干预观察方法2特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而到达理想的效果。〔五〕微分干预观察方法3缺点需要光强高，双折射物质不能到达DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂4应用：

无色透明活体标本的细微结构，无色荧光标本，染色标本，显微操作等〔五〕微分干预观察方法〔六〕浮雕相衬显微镜〔六〕浮雕相衬显微镜1原理斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本外表产生明暗差异，增加观察比照度。2.历史1975年，RobertHoffman博士创造2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品3.特点提高未染色标本的可见性和比照度；图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕；可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头)；可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织；聚光镜的工作距离可以设计的更长；RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察〔六〕浮雕相衬显微镜4.缺点观察效果与标本方向密切相关操作较复杂必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜观察荧光效果不如明场物镜5.应用所有类型的细胞，组织〔无论活体，染色，未染色〕，晶体外表细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作〔六〕浮雕相衬显微镜荧光观察方法什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发——光化荧光

荧光的种类

自发〔固有〕荧光二次荧光荧光的性质吸收光，必需有激发光源荧光波长＞激发波长〔损失热能〕荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光显微镜的优点和用途优点：检出能力高〔放大作用〕对细胞的刺激小〔可以活体染色〕能进行多重染色用途：物体构造的观察——荧光素荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的种类

透射式荧光显微镜的种类

落射式荧光显微镜的主要部件

透射式汞灯光源激发滤色镜吸收滤色镜暗场聚光镜

落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜落射荧光显微镜的构造荧光显微镜光源

汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)氙灯光源：顶峰值更宽，更稳定荧光显微镜激发透镜组

激发滤色镜:

激发波长选择激发透镜组〔激发块〕:

T%nmBANDPASS入射光发射光激发滤色镜分光滤色镜吸收滤色镜落射荧光显微镜各部件特性和作用吸收滤色镜:荧光透过,阻挡杂光分色镜:反射激发光,荧光透过＞A透过A＜A反射B＞B透过＜B阻挡nmnmT%T%A落射荧光显微镜各部件特性和作用吸收滤色镜:荧光透过,阻挡杂光分色镜:反射激发光,荧光透过＞A透过A＜A反射B＞B，＜C透过nmnmT%T%AC滤色镜的选择荧光素的特性滤色镜的特性激发分色吸收带宽对图象的影响SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI多重染色标本的多色观察FITC+TexasRed+DAPI三色滤色镜的特性曲线激发分色吸收双重染色标本的单色和双色观察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI单色滤色镜的特性曲线双色滤色镜的特性曲线现行显微镜特点和各种滤色镜自由组合激发块吸收滤色镜激发滤色镜分色镜油镜应使用荧光油

物镜光栏的运用光栏全开启光栏适当关小减少杂散光干扰荧光的衰减

防衰减的方法使用抗衰减剂选择衰减小的荧光素降低激发光强度降低标本中氧的浓度有衰减的标本使用抗衰减剂的效果汞灯灯箱构造灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮汞灯中心调节方法放置荧光调中板或一张白纸于载物台上转入B或G激发滤色镜用10X物镜观察并聚焦取下10X物镜通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心于白纸上圆环中心1.明场观察——常