质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的在体外(缓冲液中)复制DNA,使目的DNA按2"方A.变性：加热反应系统至95℃,使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温(35-70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右),与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法):A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8A260/A280<1.8A260/A280>1.8DNA纯净表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质含RNA杂质，用RNA酶去除。限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).(一)实验材料：仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒，含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、2.质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液P1(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5a3.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒DNA4.质粒DNA的酶切鉴定5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统(二)实验方法准备目的准备目的DNA:菌液煮沸10min,冷冻，室温解冻后离心取上清液取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水5.5ul、2*PremixTaq12.5ul、引物1(10mol/L)lul、引物2(10mol/L)lul、菌液5ul将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃——30秒，50℃——30秒，72℃——1分钟。循环为30次③72℃5分钟④4℃保温将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中取1.5ml培养物加入Eppendorf管中!加入250μl溶液S1,吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮颠倒4～6次混匀(不要剧烈振荡),直到溶液变得清亮加入350μl溶液S3,立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min,小心取上清液(500-800μl)将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min,弃滤液儿加入500μl去蛋白液(W1),13000rpm离心1min,弃滤液向吸附柱中加入700μl漂洗液W2,13000rpm离心1min,弃滤液；重复一遍儿空柱13000rpm离心1min,然后室温放置3min,使残留乙醇挥发取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent),室温放置1min,13000rpm离心1min洗脱质粒DNA,-20℃保存备用3.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净空白对照比色测定向比色皿加入98ul蒸馏水，进行Blank调零再向比色皿加入2ul的质粒DNA,于紫外分光光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂无菌水9.0μl、10×M酶切小心混匀试剂，将EP管置于恒温水浴箱中37℃1.5小时。扩增的DNA各6μ1于三个EP管中并做好标记往每个EP管中加入1μlGelview染料，室温放置一分钟用微量加样枪分别各吸取10ul,按序号加入到电泳仪的凝胶孔中电泳30分钟取出凝胶紫外光下观察，拍照(一)实验现象4.电泳时，可观察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度不同。在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。(二)实验结果原始实验数据测量次数质粒DNA浓度(ug/ml)Ratio比值(A260/A280)123平均值电泳后的图片A:PCR目的条带B:酶切片段C:质粒DNA(四)实验分析A260/A280<1.8表明样品中含有较多的蛋白质(芳香族)2.在图片中，其他三类DNA与Maker相比较，可知质粒DNA的分子大小在(四)实验讨论(1)碱裂解法提取质粒时，溶液I、II、III的作用分别为?溶液I:螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用；有利于溶酶体的作用。溶液II:细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。(2)结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率?①尽量选择粘端酶切和那