形态学实验 实验十 生物材料石蜡包埋实验

实验十

生物材料石蜡包埋实验

（洗涤、脱水、透明、透蜡与包埋）石蜡切片的主要步骤：一、取材二、固定三、洗涤四、脱水五、透明六、透蜡与包埋七、切片八、贴片九、染色十、封藏一、实验原理：1、洗涤洗涤是洗去渗入细胞内部的固定液。因为材料中的固定液有的会妨碍染色；有的会发生沉淀或结晶；有的会继续与组织作用，使材料变坏等。因此要彻底洗净固定液。2、脱水:

材料经洗涤后含有大量的水分，必须用脱水剂脱尽里面的水分，有利于材料的透明和制片的保存。因为水分会使材料分解，而且透明剂与水是不相混合的，因此只有在完全无水的情况下，透明剂才能完全透入到组织当中。3、透明：是指利用透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，将脱水剂替换出来，使石蜡能顺利进入材料中，达到不同程度的透明状态。4、透蜡：是指将材料中的透明剂逐步清除，以至完全由石蜡充分渗透。5、包埋：是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起倒入一定形状的容器内，并立即让其冷却，使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。常用的脱水剂：

酒精、丙酮、甘油、正丁醇、二氧乙环等。常用的透明剂：

二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油等。透明剂都是石蜡的溶剂，绝大多数不能与水混合。常用的包埋剂：石蜡（熔点42～60℃），分软蜡（熔点42～50℃）和硬蜡（熔点52～60℃），一般动物材料最常用52～56℃熔点的硬蜡。夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔点的石蜡。二、实验步骤1、洗涤

材料自固定液中取出，放入指形管或广口瓶，加入半管水，用纱布将管口扎住，置于水槽内，进行流水冲洗。注意水流不宜太急，以免冲坏材料。流水冲洗时间一般需要12～24小时。冲洗时应注意以下事项：

水溶性的固定剂：需用流水冲洗。酒精溶剂的固定剂：应用同浓度的酒精浸洗。含苦味酸的固定剂：（苦味酸与甲醛混合液除外），须用70％酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。福尔马林固定剂：除长期存放外，一般可以不冲洗。

含有升汞固定剂：组织经固定后应在冲洗剂－水或酒精中加碘以洗去组织内汞的沉淀。含有铬酸的固定剂：组织在冲洗时最好置于暗处，以免产生沉淀或使组织硬化而影响制片。

2、脱水材料自低浓度至高浓度的酒精进行脱水。一般经50%、70%、80%、95%直至纯酒精。每级停留约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。脱水时的注意事项：①脱水必须要在有瓶盖的器皿中进行，尤其是高浓度乙醇很容易吸收空气中的水份。②组织由低浓度向高浓度的乙醇转移时，要用吸水纸吸干余液，以免将水份带入。③在低浓度酒精中，每级停留时间不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。④在高浓度或纯酒精中，每级停留时间不宜过长，否则会使组织变脆，影响切片。3、透明透明也是渐次由低浓度至高浓度进行，要求每级更换动作要迅速，盖好相应的盖子。材料先在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15～30分钟，再转入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15～30分钟。若透明过程中，材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。总的透明时间不宜超过3h。4、透蜡

材料自二甲苯中取出后，先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中约30分钟（透蜡格1），然后进入纯石蜡中约40～60分钟（透蜡格2），

再换纯石蜡一次约40～60分钟（透蜡格3）。透蜡温度要恒定（放置60℃水浴锅中)，一般要求在52～56℃之间，以石蜡不凝固为好，并且要在最短的时间内完成，以免组织变硬、变脆、收缩等。透蜡格:5、包埋从自动熔蜡机中取出石蜡模子(下图)注入适当的石蜡，再用温镊子取出透蜡格3中的组织样品，迅速转移到已注入石蜡的石蜡模子底部(中央)，放上包埋盒(预先在包埋盒侧面做好标记，文字面朝上)，再注入石蜡(不溢出包埋盒为宜)，转移石蜡模子到冰面上，待石蜡完全凝固（约30分钟）后取出包埋盒，备用。所有用过的石蜡模子都要放回熔蜡机中，以便再次使用。

注意：包埋盒请标明学生姓名、组织样品名称，以免混淆或拿错。普通包埋机带冷台包埋机包埋过程标记注入适当石蜡放入组织样品正确放入包埋盒再注入石蜡并移至冰面凝固取出具体操作步骤：取材(鼠肝、脾、肾、心3mm)

→固定(10％福尔马林，12～24h)

↙

(流水冲洗12～24h)

洗涤↙

脱水→50%乙醇，30min→70%乙醇,30min

→80%乙醇，30min

→95%乙醇,30min

→无水乙醇，30min

透明→50%纯乙醇﹢50%二甲苯，15min

→纯二甲苯，30min（出现雾状，重新脫水)

透蜡→二甲苯﹢等量石蜡，56℃水浴锅，30min

→纯石蜡，56℃水浴锅，40min

→纯石蜡，56℃水浴锅，60min

包埋→用包埋机包埋，每盒放1个组织块，放冰上冷却，待石蜡凝固后取出备用。三、实验用品1、器材：水浴锅、透蜡格、包埋机、石蜡模子、包埋盒、镊子、方盘等。2、试剂：各级酒精（50、70、80、9