形态学实验-哺乳动物细胞培养

实验十一

哺乳动物细胞培养目录细胞培养基本概念细胞培养基本要求细胞培养基本技术一、细胞培养基本概念细胞培养定义细胞培养简史生长类型细胞形态传代次数细胞培养定义定义：

模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。优点：1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。

细胞培养简史细胞类型按生长方式:贴壁型细胞（Monolayercells）悬浮型细胞（Suspensioncells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞（Fibroblast-likedcells）上皮型细胞（Epithelium-likedcells）其它，不定型

成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源

上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等

游走型细胞散在生长，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期多形细胞型

难以确定规律和稳定的形态

如神经组织的细胞等

细胞形态接触抑制（Contactinhibition）细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。细胞周期：一个母细胞分裂结束后形成的细胞至其下一次再分裂形成子细胞的这段时间。体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。

细胞传代次数（PassageNumber）

原代培养

（primary

culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

细胞系（cell

line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖

细胞株（cell

strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。原代培养与细胞系

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA细胞系资源二、细胞培养基本要求常用仪器设备培养器皿培养基血清其他细胞培养试剂常用仪器设备超净台或生物安全柜：细胞操作CO2

培养箱：细胞培养液氮罐：细胞长期冻存37℃水浴：培养溶液预热，细胞复苏倒置显微镜：观察细胞离心机：收集细胞，细胞常用300g转速5min冰箱：细胞培养溶液分装储存负压吸引器：细胞培养废液吸取超净台或生物安全柜垂直风超净台水平风超净台生物安全柜CultureflaskCulture

Plate

培养器皿细胞培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考：

建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

血清使用注意事项血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活（heat-inactivation）是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。

勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。

显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。

血清沉淀物

谷氨酰胺谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为1-4mM一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L）配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM酚红大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH黄色代表酸性pH紫色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用细胞消化液分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA·4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。

注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长三、细胞培养基本技术细胞原代培养细胞换液与传代细胞冻存与复苏细胞计数与活力细胞污染与控制鼠胎组织细胞原代培养取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养换液：全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄。细胞换液细胞传代目的：原代细胞传代以便获得稳定的细胞株，或细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。接触抑制、营养枯竭传代培养：将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增3～6次。细胞冻存冷冻保存要点冷冻过程要缓慢：4℃30－60分钟→-20℃30分钟→-80℃16－18小时（或过夜）→液氮长期保存或使用程序降温盒，每秒下降1℃冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。常用细胞冷冻保存液5%或10％DMSO＋完全培养液10％甘油＋完全培养液细胞复苏快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中细胞污染细菌污染真菌污染细菌和真菌的清除支原体污染支原体的清除细菌污染

细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

真菌污染真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

细菌和真菌的清除

使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）精氨酸支原体（M.arginini）猪鼻支原体（M.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）危害：世界性问题，平均发生率达到11%能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：操作环境不良操作人员的疏失实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的培养基、血清支原体污染荧光染色法电镜检查：扫描电镜、透射电镜支原体培养聚合酶链反应(PCR)法支原体污染检测细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓