形态学实验 石蜡切片法-染色、封藏

四、石蜡切片法

染色、封藏1石蜡切片的主要步骤：一、取材二、固定三、洗涤四、脱水五、透明六、透蜡与包埋七、切片八、贴片九、染色十、封藏2一、实验原理：1、染色：细胞和组织的不同结构之所以能被染成各种不同的颜色，是由于染料对它们所起的物理与化学综合作用的结果。3（1）物理作用：渗透作用：染料渗透到多孔的组织中，与组织没有牢固的结合。吸收作用：组织吸收染料中的色素粒子，与之牢固结合而呈颜色。吸附作用：染料中分散的色素粒子进入到组织细胞的间隙内，由于分子的引力作用，使色素粒子被吸附而染色。如蛋白质、核酸、胶体等有不同的吸附面，对染料离子的吸附有选择性而呈不同颜色。4（2）化学作用：是因为细胞内含有酸性和碱性物质可分别与染料中的阳离子和阴离子互相结合，这种反应使组织细胞染上颜色。5（3）以常用的苏木精-伊红（H.E）对染法为例：细胞核内含有酸性物质，易与碱性染料苏木精中有染色作用的阳离子结合，细胞核被染上蓝色。细胞质含有碱性物质，易与酸性染料伊红中有染色作用的阴离子结合，细胞质被伊红染上粉红色。但是嗜碱性和嗜酸性是相对的，因此在染料液中停留时间不宜过长。6常用的染料：生物学上的染料按来源分为天然染料和人工染料。1、天然染料：苏木精、洋红、地衣红、靛青等。2、人工染料：碱性染料：番红、美蓝、结晶紫、碱性品红。酸性染料：伊红、固绿、苏丹红、酸性品红。72、封藏：封藏是使已经透明的材料保存在适合折光率的封藏剂中，使材料能在显微镜下清晰的显示出来，并能长期保存。常用的封藏剂为树胶，折光率为1.52，与玻璃的折光率1.51很接近。8二、实验程序1、染色的一般方法由于要染的切片包在石蜡之中，而所用的染色剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水，石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经过各级酒精处理，下降至水。经染色后需再脱水，上升到二甲苯透明，然后封藏。9H.E染法:从左到右，(1)-(19)缸1.二甲苯(1)脱蜡10min。2.二甲苯(2)脱蜡10min。3.100%乙醇（3）、100%乙醇（4），95%（5）、80%（6）、70%（7）酒精各2min。4.蒸馏水（8）

1min。5.Mayer’s苏木精染色液30min。6.自来水兰化107.1%伊红（12）水溶液5min。8.蒸馏水（12.5）过一下。9.70%（13）、80%乙醇（14）、95%（15）、无水乙醇（16）、无水乙醇（17），每次各2min。14.二甲苯(18)

5min。15.二甲苯(19)

5min。16.封藏：封藏于中性树胶中。(粘取)17.显微镜观察结果：细胞核蓝色，细胞质粉红色112、封藏的方法从二甲苯缸中取出含组织的载玻片放在玻片板上，（有组织切片一面朝上），迅速粘取树胶于组织中央（千万不能待二甲苯干燥后再进行），手轻轻地夹住盖玻片的一侧，稍微倾斜使其对侧与封藏剂接触成线状后，再缓慢放下盖玻片，避免中间产生气泡。12

根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。若胶液不足，可从盖玻片边缘补足；若胶液过多，则等干燥后用刀片刮去，并用纱布蘸二甲苯擦去残留的树胶。13HE染色应注意以下几个问题：1．组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行那种染色都会发生困难。脱蜡时间要充分，若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低，若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。2．苏木精染液使用一段时间后表面易出现亮晶状飘浮物，这可能是液体表面的过氧化物，必须过滤除去，以防沉渣污染组织切片，或应及时更换新液。

143．染色的时间长短需依据染色剂对组织的染色作用，室温条件，切片厚薄，固定液的类别，染液的新旧而进行调节。所以在染色时必须使用显微镜观察染色程度以利掌握时间。4．分化十分重要。分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色不匀或过淡、过深等现象，因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞浆呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后，组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。155．还原液不宜过浓，若碱性太强易使组织脱落故以淡为宜。6．伊红宜淡染，复染过深胞核会不清晰，影响镜检。7．若脱水、透明等步骤不够彻底，则组织表面会有一层雾状膜。若有这一现象，应立即更换纯酒精脱水，再次透明。168．染色后的组织切片、要将组织四周的污染物痕迹擦掉，以免影响美观。9．封片剂要适量，滴加时应小心倾滴，盖玻片要轻轻放置，以免气泡产生影响镜检。盖玻片大小选择要合适，一般要大于组织块，以防封盖不全，盖玻片要放正，标签贴牢，编号清楚。从而保证切片的封藏和美观。10．染好的切片应妥为保存，更应避免日光照射，否则切片容易褪色。17三、实验用品1、器材：玻璃缸、染色缸、镊子、盖玻片、显微镜等。2、试剂：不同浓度梯度的酒精、二甲苯，粘片剂，苏木精、伊红染色液。3、材料：已切好的石蜡切片。18四、作业1、在显微镜下观察切片的制作效果和细胞形态，由老师打分，上交HE染色玻片2片。2、考察显微镜的基本操作方法和注意事项。19小鼠肝脏（10×4）20小鼠肝脏（10×10）肝小叶↗血管↖21小鼠肝脏（10×40）22小鼠脾脏（10×4）23小鼠脾脏（10×10）红