野生哺乳动物物种DNA分子鉴定技术规程

3DBXX/XXXXX—XXXX野生哺乳动物物种DNA分子鉴定技术规程本标准规定了利用线粒体DNA对野生哺乳动物进行物种鉴定的原理、试剂、仪器、分析步骤和结果判定。本标准适用于NCBI收录范围内的野生哺乳动物分子物种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT35918-2018动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法LY/T2501-2015野生动物及其产品的物种鉴定规范3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction,PCR用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.1.2线粒体细胞色素b基因Cytochromeb线粒体细胞色素b基因作为线粒体基因组中的蛋白质编码基因之一，具有单拷贝、易扩增的特点，可用于物种的准确鉴定。3.1.3DNA序列测定DNAsequencing测定DNA分子的核苷酸排列顺序。3.1.4序列比对Alignment为确定两个或多个序列之间的相似性以至于同源性，而将他们按照一定的规律排列。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。NCBI:美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrithylammoniumBromide）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphate）4DBXX/XXXXX—XXXXTaqDNA聚合酶：耐热DNA聚合酶（TaqDNAPolymerase）EDTA:乙二胺四乙酸（EthyleneDiaminetetraaceticAcid）Tris:三羟基胺基甲烷（Tris(hydroxymethyl)Aminomethane）SDS：十二烷基硫酸钠4原理利用通用引物对野生哺乳动物的线粒体DNACytb进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化、测序，得到目的片段序列，将所得序列在数据库中进行序列比对，确定物种。5分子鉴定技术5.1仪器设备及试剂仪器设备及试剂参见附录A。5.2引物表1线粒体DNACytb进行PCR扩增所用引物引物名称引物序列（5’-3’）参考文献L14724GATATGAAAAACCATCGTTGIrwinetal.1991H15149CTCAGAATGATATTTGTCCTCAIrwinetal.19915.3操作程序5.3.1样品准备待鉴定样品可以是新鲜的皮毛、肌肉、器官组织、血液等。通过现场或实验室取样，将采集到的样品（如：肌肉、肝脏、皮毛等）用蒸馏水洗净后放入盛有95%酒精的离心管中，4℃保存待用。5.3.2基因组总DNA提取将取回样品用蒸馏水洗净后，用标准的SDS变性、蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提方法提取总DNA，具体操作参照《分子克隆实验指南（第3版）》等的方法沉淀DNA，收集絮状沉淀，用70%乙醇洗涤两次，室温干燥后加入适量TE溶解DNA。5.3.3总DNA质量控制DNA纯度检测吸取1µL~3µL提取的DNA，用1%~2％琼脂糖凝胶100V电泳30min，检测所提取DNA的质量。紫外光照射下DNA凝胶条带应单一、整齐、明亮。5DBXX/XXXXX—XXXXDNA浓度检测1、紫外吸收定性测试分别于260nm波长和280nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260／A280比值在1.8~2.0范围内，方可正常进行后续实验。2、紫外吸收定量测试DNA浓度(μg/mL)=[A260／(0.020×L)]×稀释倍数，式中A260为被测样品在260nm波长下的吸光度值，L为比色池厚度，单位cm。DNA浓度宜在10μg/mL以上，方可正常进行后续实验。5.3.4PCR扩增利用推荐的线粒体Cytb特异性引物，对提取的DNA样品进行PCR扩增。PCR反应体系为25ul，体系内含1μlMgcl2（50uM2.5μlbuffer（10×),1.5μldNTP（2.5uM0.3μlTaq聚合酶(5U/mL)，引物各0.5μl（10mol/L）,0.5μL~1μLDNA,，加水H2O至25ul。扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸/90s，34个循环，72℃终延伸5min，4℃终止反应。L14724/H15149,72℃延伸90秒。5.3.5电泳取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分融化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度0.5ug/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将25µLPCR扩增产物分别和适量的加样缓冲液混合，点样，同时点加分子量标准品，9V/cm电泳仪中恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中上部，用凝胶成像系统观察电泳结果，目标条带为500bp左右。5.3.6测序对得到的特异性PCR产物进行回收和纯化后，用测序仪进行PCR产物直接双向测序。每条序列均经双向测定，以确保序列的准确性。6数据分析和物种鉴定利用NCBI的GenBank数据库的Blast基因搜索功能对待鉴定个体扩增的DNA序列进行比对分析。根据差异值来确定物种之间的关系。通常情况下，序列相似度≥98%确定为同一物种。当出现两种以上物种序列相似度均超过98%时，或序列相似度均＜98%时，需结合地理分布、时间等其他信息进行综合分析确定。6DBXX/XXXXX—XXXX附录A仪器设备及试剂A.1仪器设备A.1.1PCR仪A.1.2凝胶成像系统A.1.3高速离心机A.1.4电泳仪A.1.5电泳槽A.1.6微量移液枪（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）A.1.7电子天平（量程0.01-300mg）A.1.8恒温水浴锅A.1.9紫外分光光度计A.1.10超纯水器A.1.11Sanger测序仪A.1.11冰箱A.1.11微波炉A.1.11高压灭菌锅A.1.13PH酸度计A.2试剂A.2.1裂解液（20.00g/LCTAB,81.9g/LNacl,12.1g/LTris,7.50g/LNa2EDTA,pH8.0）A.2.2核苷酸(RNA)酶A.2.3三羟甲基氨基甲烷饱和酚(Tris饱和酚)A.2.4三氯甲烷A.2.5异戊醇A.2.6无水乙醇A.2.7溴化乙锭（10mg/mL）A.2.810×Tris硼酸(10×TBE)电泳缓冲液A.2.7100bpDNA分子量标记A.2.8琼脂糖：分析纯A.2.9蛋白酶K（20mg/mL）A.2.10TaqDNA聚合酶（5U/μL）A.2.11dNTP混合液A.2.12分子量标准品（最小片段≥20，最大片段≤2000）A.2.13超纯水A.2.14TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mMEDTA）7DBXX/XXXXX—XXXX参考文献Lopez-OcejaA,GamarraD,BorraganS,Jimenez-MorenoS,dePancorboMM.2016.Newcytbgeneuniversalprimersetforforensicanalysis.Forensic