动态显色法检测4种清热解毒类中药注射液中细菌内毒素含量

动态显色法检测4种清热解毒类中药注射液中细菌内毒素含量目的：建立定量检测4种清热解毒类中药注射液中细菌内毒素的试验方法。方法：承受动态显色法，测定温度为〔37±0.5〕405nm，预设〔四部〕4〔验中标准曲线的相关系数r为0.999；清开灵注射液、复方半边莲注射液、茵栀黄200、125、75、12.5倍及以下稀释倍数时对50%～200%1.66、1.04、0.62、0.104EU/mL，均低于各样品规定的限值。结4结果稳定牢靠。OBJECTIVE：Tosetupthemethodforquantitativedeterminationofbacterialendotoxinin4kindsofheat-clearinganddetoxifyingTCMinjections.METHODS：Thekineticchromogenicassay〔KCA〕methodwasused.Thedeterminationconditionsincludeddetectiontemperature〔37±0.5〕℃，detectionwavelength405nm，presetabsorbance〔A〕0.1，andreactiontime3600s.Accordingtophotometrymethodandguidanceprinciplegeneralruleofbacterialendotoxintestin2023editionofChinesePharmacopoeia〔partⅣ，reliabilitytestand interference test of standard curve were conducted. The non-interferenceconcentrationof4type〔Qingkailinginjection，CompoundBanbianlianinjection，Yinzhihuang injection and Shuanghuanglian injection〕was determined andquantitativedeterminationofbacterialendotoxinwasalsoconducted.RESULTS：Thecorrelationcoefficientrofstandardcurvewas0.999.Qingkailinginjection，CompoundBanbianlianinjection，YinzhihuanginjectionandShuanghuanglianinjectiondidn’tinterferewiththedetectionoftachypleusamebocytelysatein200，125，75and12.5timesandbelowdilutiontimesrespectively.Therecoverieswereandthecontentsofbacterialendotoxininsampleswere1.66，1.04，0.62，0.104 EU/mL，which were all lower than the limits of samples.suitableforthedetectionofbacterialendotoxinin4kindsofTCMinjections.Themethodissimple，convenient，stableandreliable.KEYWORDSKineticchromogenicassay；Heat-clearinganddetoxifying；TCMinjection；Bacterialendotoxin；Interferencetest4[1-8][9-11]2023年3种分别收载在《国家中成药标准汇编：中成〔复方半边莲注射双黄连注射液〕和WS3-B-2736-97〔茵栀黄注射液〕中。这4种中药注射液的热原检查方法4种均〔1～5ng/kg〕的内毒素进入人体即可引起发热反响[12]；大剂量的细菌内毒素可引起机体发生内毒素休克、弥散性血管内凝血、多器官衰竭等反响甚至死亡[13-15]。长、储存、运输、生产过程的特别性，易受到微生物污染，加之细菌内毒素本身具有水溶性、耐热性、吸附性及不挥发性等性质[16]，使中药注射液中的细菌内assay，KCA〕是光度测定法中显色基质法灵敏度高、适用性强、操作简便，可批量检测故能节约时间和本钱。本争论承受KCA对上述4种清热解毒类中药注射液的细菌内毒素含量进展检测，以建立4种中药注射液中细菌内毒素的定量检测方法。材料仪器MultiskanFC型内毒素仪〔赛默飞世尔科技公司；BioProde5.2〔湛江安度斯生物2H-2BLENDER涡旋振荡混合器〔仪器厂。药品与试剂清开灵注射液〔河南省神农药业，批号：1608041、16071102、1604040，规格：10mL支；复方半边莲注射液〔河南同源制药，批1612011704011707012mL支；茵栀黄注射液〔神威药业集团170611D170612D170613D10mL支；双黄连注射液〔河南福森药业集团，批号：1602023、1604363、1604413，规20mL支；细菌内毒素工作标准品〔CS150601-20238，规格：支〕均来源于中国食品药品检定争论院；KCA鲎试剂〔批号：1604220，规格：0.35mL/20～0.01EU/mL、细菌内毒素检查反响板〔1510080〕均来源于湛江安度斯生物。方法供试品细菌内毒素限值确实定K=5EU〔kg·h。首先去除稀释液的最大允许细菌内毒素KKs=K-KM为人每千克体质量每小时可承受的最大供试品剂量，以mL/〔kg·h〕表示。按供试品说明书规定，取每日人用最大体积V进展60kg250mL葡萄糖注射液或氯化1h计算，M=V/6012023年版《中国〔四部〕规定[17]，由于药物使用途径不同，为保证安全用药，药品的L1/2～1/31/3L。通过L2.0、5.0、3.0、1.0EU/mL。标准曲线牢靠性试验〔四部〕方法操作[17]。1BET800μL15minBET水稀释成1.0、0.1、0.01EU/mL3个浓度，同时设阴性比照管。另取KCA鲎试剂，加0.35mLBET水，充分溶解。取上述CSE25μL，加至32KCA，吸〔A〕测定条件：温度〔37±0.5〕405nmA0.1，反响时间〔T〕3600s，仪器自动以T的对数值〔lgT〕为横坐标，以质量浓度〔c〕的对数值lg〕为纵坐标，绘制标准曲线，计算相关系数〔。供试品干扰试验细菌内毒素系列溶液〔C溶液〕1.0、0.1、EU/mL3CSEE1.0、E0.1、E0.01。供试品溶液〔A溶液〕的稀释在不超过最大稀释倍数〔MVD〕下用BET24S1S2S3、S4。〔B溶液0.1EU/mL浓度的细菌内毒λmS10.2EU/mLCSE溶液混合，即得到0.1EU/mLS2T0.1。同样S1T0.1、S3T0.1、S4T0.1一系列的供试品阳性溶液。KCA鲎试剂反响取A、B、CKCA25μL，加至2BET水作为阴性比照〔即D溶液2孔。依照“2.2”项下条件测定。依据标准曲线所得回归方程计算各供试品ctcS，按下式计算该试验条RR〔cS-c50～200%之间。供试品细菌内毒素含量测定EU/mL表示，并进展样品细菌内毒素回收率测定。3结果标准曲线的牢靠性〔四部〕[17]及鲎试剂使用说明书对光度测定法r确实定值T〔CV〕≤10%。将标准曲线进展线性回归，得到回T>3600s〔标准曲线最T3397.5sCV均%。可见，标准曲线试验成立，说明试验有效。KCA1。供试品干扰试验结果清开灵注射液、复方半边莲注射液、茵栀黄注射液、双黄连注射液分别在50%～200%，说明在该稀释倍数4种注射液的最大无干扰浓度200、125、75、12.5倍。122。供试品中细菌内毒素的测定〔lgT=2.8429分别计算4个品种A溶液最大无干扰浓度下的细菌内毒素含量。结果，各组平CV3600s量实测值均<0.0083EU/mL，说明清开灵注射液、复方半边莲注射液、茵栀黄注均不超过各品种规定的细菌内毒素限值。4争论[1]、肺炎、高烧，具有解热作用[2]，能有效抑制细菌内毒素等致热原引起的家兔发热反响。复方半边莲[3]。茵栀黄药注射剂，具有清热、解毒、利湿、退黄的成效[4]悉黄、胸胁胀痛、恶心呕吐、小便黄赤，急性、迁延性、慢性肝炎等属上述证性腭扁桃体炎等[5-6]疾病的首选药物之一[7-8]。自二十世纪八九十年月起中药抗细菌内毒素的作用开头引起宽阔学者的重视。有争论[18]报道，大青叶提取物具有体外破坏细菌内毒素的作用，细菌内毒素与大青叶提取物接触后，注入家兔体内未引起发热效果。另有争论[19]报道，大黄能显著抑制家兔细菌内毒素性发热故热原法有可能不能检出有清热解毒作用的中药注射液中所含细菌内毒素本争论中选择的4种中药注射液均属于清热解毒类故需建立体外的方法检测这4种中药注射液是否被细菌内毒素污染以及其中的细菌内毒素含量。结果，样品中添加细菌内毒素后回收率均在 50%～200%，说明方法准确。经体外检测各样品中细菌内毒素含量均远远低于规定的限值与前期试验中4种制剂承受家兔法检测无热原反响的结果相吻合但本试验未对家兔法进展深入争论比方样品受细菌内毒素污染后对家兔发热的抑制作用有待进一步深入探讨。中药注射液成分简单，颜色较深，已有文献报道的体外检测方法，或不适用于某些中药注射液品种[20]，或检测方法较简单，需多种试剂进展试验[21]。而本试验所承受的检测方法，所用试剂简洁，大大简化了试验操作，且检测浓度范20～0.01EU/mL浓度的细菌内毒素。由本试验结果可知，由于检测手段具有较高的灵敏度，故供试品有更大的MVD，在小于MVD的稀释倍数下，供试品不存在干扰作用。且在添加不同浓度的CSE果较为稳定。参考文献1]何义霞.清开灵注射液治疗小儿肺炎的临床分析[J].中国现代药物应用，2023，8〔13：155-156.2 吴剑波，何志民.清开灵注射液联合糖皮质激素对大叶性肺炎患者血清IL-10TNF-α水平的影响[J].中国生化药物杂志，2023，36〔4〕：152-154.[3]杨聪琴.复方半边莲治疗小儿急性支气管炎疗效观看[J].有用中医药杂2023，21〔3：136-137.4 茵栀黄注射液对黄疸型病毒性肝炎的退黄效果与安全性的系统评价[J].2023，5〔6：461-465.5 双黄连注射液治疗慢性堵塞性肺疾病急性加重期患者的临床观看[J].中国药房，2023，2〔29：4096-4098.6 双黄连注射剂与抗生素比较治疗小儿肺炎[J].2023，22〔7：1790-1793.[7]桂曼青.[J].航空航天医学杂志，2023，25〔5：692-693.[8]张海英，任晓蕾，李玉珍.双黄连注射液治疗小儿肺炎有效性的Meta[J].中国药房，2023，21〔44：4205-4207.[]23例临床分析[J].中国社区20231〔1079-80.[10]陈文贵.[J].1995，6〔5：47-48.24：1919-1920.党京丹.[J].20234〔7：771-773.[13]孙哲.[J].20231〔9128-130.HIRATAN，YANAQAWAY，SATOHM，etal.Dendriticcell-derivedTNF-alphaisresponsiblefordevelopmentofIL-10-producingCD4+Tcell[J].CellImmunol，2023，261〔1〕：37-41.NEWBYAC.Metalloproteinaseexpressioninmonocytesandmacrophagesanditsrelationshiptoatheroseleroticplaqueinstability[J].ArteriosclerTh