DB32T3762.10-2020新型冠状病毒检测技术规范 第10部分：微量血清中和试验

ICS11.020

C62

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3762.10—2020

新型冠状病毒检测技术规范

第10部分：微量血清中和试验

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part10:Serummicroneutralizationtest

2020-07-29发布2020-07-30实施

江苏省市场监督管理局发布

DB32/T3762.10—2020

新型冠状病毒检测技术规范第10部分：微量血清中和试验

1范围

本部分规定了新型冠状病毒微量血清中和试验环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤、

结果判定和清场与消毒。

本部分适用于新型冠状病毒实验室微量血清中和试验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

新型冠状病毒实验室生物安全指南中华人民共和国国家卫生健康委员会

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

3.1

微量血清中和试验serummicroneutralizationtest

将病原体及其产物（毒素）与免疫血清相混合，在体内或体外检测其致病力的试验，用以检查动物

的免疫状态，测定抗原滴度，以及病原鉴定等。

3.2

细胞病变效应cytopathiceffect，CPE

病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引

起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体，

乃至细胞裂解等。

3.3

半数组织培养感染剂量mediantissuecultureinfectivedose(TCID50)

能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。

4环境与设施

4.1实验室资质及级别要求

1

DB32/T3762.10—2020

应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定、

中和试验等实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。实验室开展相关活动

前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。

4.2操作人员资质及防护要求

实验操作人员应经过生物安全培训并取得BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下经

实验室主任批准后方可开展活动。操作人员应根据《新型冠状病毒实验室生物安全指南》要求，按照

BSL-3个人防护的要求进行防护。

5设备与耗材

5.1设备

生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、冰箱、CO2培养箱等。

5.2耗材

N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶

手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、一次性平皿、离心管、96孔细胞培养板等。

6试剂与材料

6.1试剂

6.1.1Hanks溶液（每毫升含青霉素、链霉素各2000单位）

6.1.2DMEM培养液（含10%胎牛血清）。

6.1.3DMEM维持液（含2%胎牛血清）。

6.1.4消化液（0.25%胰酶和0.025%EDTA-Na2混合液）。

6.2材料

6.2.1已滴定的新型冠状病毒悬液。

6.2.2阳性对照血清、阴性对照血清（正常血清）及待检血清。

6.2.3非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）、人呼吸道上皮细胞、人肝癌细胞（Huh7）或其它敏感细胞。

7试验技术要点

7.1确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒病毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果，

三次实验结果的滴度波动不应超过+/-0.5。

7.2中和抗体滴度的判定是以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，因此设置对照实验十

分重要。

7.3采用固定病毒—稀释血清的方法进行微量中和试验。

8操作步骤

8.1实验前准备

2

DB32/T3762.10—2020

8.1.1将实验所需细胞置37℃5%CO2培养箱培养至单层，在进入BSL-3接种病毒前，弃掉细胞培养

液，用Hanks溶液洗3次。

8.1.2配备消毒液：75%乙醇、有效氯5500mg/L的含氯消毒液。

8.1.3将细胞、病毒、血清、试剂和耗材一次性带入BSL-3核心区。

8.2血清稀释

8.2.1血清的处理：将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清56℃水浴灭活30min，为防止管盖

崩开，要用封口膜封管口。待冷却后移至生物安全柜内进行稀释。

8.2.2在生物安全柜里，将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清用DMEM维持液做倍比稀释，

使其稀释度分别为1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每管量为0.5ml。每一稀释度必须更

换吸头，吹打混匀。

8.3病毒稀释

在生物安全柜里，用DMEM维持液稀释病毒至100TCID50/0.1ml。

8.4血清与病毒结合

8.4.1在上述各稀释的血清管内加0.5ml病毒稀释液（100TCID50/0.1ml），充分混匀，拧紧管盖，

用封口膜封口后置37℃水浴1h。

8.4.2病毒对照为0.5ml病毒稀释液（100TCID50/0.1ml）加0.5ml的维持液，同样用封口膜封口后

置37℃水浴1h。

8.4.3正常细胞对照不加病毒，仅含DMEM维持液。

8.5接种细胞

8.5.1弃去细胞培养孔中的Hanks液。

8.5.2将每个稀释度的血清病毒混合物接种到单层细胞上，每一稀释度接种4孔，每孔0.2ml。

8.5.3将接种好样品的96孔培养板置37℃5%CO2培养箱中培养。

8.6结果观察

每24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（CPE），并记录结果，观察5d～7d，以0%～25%细胞

CPE变化为“+”，26%～50%细胞CPE变化为“++”，51%～75%细胞CPE变化为“+++”，76%～100%细胞

CPE变化为“++++”，正常细胞形态为“-”。以病毒对照出现“+++～++++”时，结束试验。

9结果判定

9.1质控要求

正常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现“+++～++++”的CPE变化；能够阻止产

生CPE的阳性对照血清可以中和病毒的感染性，故阳性对照血清孔应无CPE，与正常细胞对照孔相同；

阴性对照血清孔的CPE情况应与病毒对照孔相同。

9.250%血清中和终点的计算

50%血清中和终点为能保护50%细胞不产生病变的血清最高稀释度，即为中和终点，可按

Reed-Muench法计算结果，参见表1。

3

DB32/T3762.10—2020

表1某新型冠状病毒病人恢复期血清50%血清中和终点的计算

细胞

累计阳性

细胞病变管数病变分布

血清稀释度阳性率（%）

/总管数

（+）管（-）管（+）↓（-）↑比例

1:4（10-0.6)0/4040160/160

1:8(10-0.9)0/4040120/120

1:16(10-1.2)0/404080/80

1:32(10-1.5)1/413141/520

1:64(10-1.8)3/431414/580

1:128(10-2.1)4/440808/8100

注1：计算公式为：lg50%血清中和终点=b+d×c,b为小于50%阳性率血清稀释度的对数，d为距离比例，c为稀释系数

的对数，其中d=（50－小于50%的阳性率）/（大于50的阳性率－小于50%的阳性率）。

注2：本例中：d=(50－20)/(80－20)＝0.5，lg50%血清中和终点=-1.5+0.5×(-0.3)=-1.65，-1.65的反对数为1:45，既1:45

的血清可保护50%细胞不产生病变。

10清场与消毒

10.1操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用75％乙醇擦拭外表面后，移出生物安全柜。

10.2将实验过程产生的所有污染材料经121℃，30min高压消毒灭菌处理。

10.3用新鲜配制的有效氯5500mg/L的含氯消毒液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，不要擦拭

顶棚，作用后用清水擦拭以除去残余消毒液，关闭生物安全柜，紫外灯消毒30min。

10.4按照合理程序在指定脱卸区域脱卸个人防护用品，退出BSL-3，填写BSL-3相关实验记录。

_________________________________

4

DB32/T3762.10—2020

前  言

DB32/T3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分：

——第1部分：生物样本采集、运输和保存；

——第2部分：病毒分离与鉴定；

——第3部分：核酸荧光PCR检测程序；

——第4部分：重组酶介导等温扩增程序；

——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序；

——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序；

——第7部分：空气样本检测与评估；

——第8部分：物体表面检测与评估；

——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估；

——第10部分：微量血清中和试验；

——第11部分：全基因组高通量测序。

本部分为DB32/T3762的第10部分。

本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本部分由江苏省卫生健康委员会提出。

本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。

本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、

昆山市疾病预防控制中心。

本部分主要起草人：葛以跃、崔仑标、迟莹、郭喜玲、陈银、朱宝立、程军平、钱志远、罗晓明、

沈欢喜。

I

DB32/T3762.10—2020

新型冠状病毒检测技术规范第10部分：微量血清中和试验

1范围

本部分规定了新型冠状病毒微量血清中和试验环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤、

结果判定和清场与消毒。

本部分适用于新型冠状病毒实验室微量血清中和试验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

新型冠状病毒实验室生物安全指南中华人民共和国国家卫生健康委员会

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

3.1

微量血清中和试验serummicroneutralizationtest

将病原体及其产物（毒素）与免疫血清相混合，在体内或体外检测其致病力的试验，用以检查动物

的免疫状态，测定抗原滴度，以及病原鉴定等。

3.2

细胞病变效应cytopathiceffect，CPE

病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引

起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体，

乃至细胞裂解等。

3.3

半数组织培养感染剂量mediantissuecultureinfectivedose(TCID50)

能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。

4环境与设施

4.1实验室资质及级别要求

1

DB32/T3762.10—2020

应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定、

中和试验等实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。实验室开展相关活动

前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。

4.2操作人员资质及防护要求

实验操作人员应经过生物安全培训并取得BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下经

实验室主任批准后方可开展活动。操作人员应根据《新型冠状病毒实验室生物安全指南》要求，按照

BSL-3个人防护的要求进行防护。

5设备与耗材

5.1设备

生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、冰箱、CO2培养箱等。

5.2耗材

N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶

手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、一次性平皿、离心管、96孔细胞培养板等。

6试剂与材料

6.1试剂

6.1.1Hanks溶液（每毫升含青霉素、链霉素各2000单位）

6.1.2DMEM培养液（含10%胎牛血清）。

6.1.3DMEM维持液（含2%胎牛血清）。

6.1.4消化液（0.25%胰酶和0.025%EDTA-Na2混合液）。

6.2材料

6.2.1已滴定的新型冠状病毒悬液。

6.2.2阳性对照血清、阴性对照血清（正常血清）及待检血清。

6.2.3非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）、人呼吸道上皮细胞、人肝癌细胞（Huh7）或其它敏感细胞。

7试验技术要点

7.1确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒病毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果，

三次实验结果的滴度波动不应超过+/-0.5。

7.2中和抗体滴度的判定是以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，因此设置对照实验十

分重要。

7.3采用固定病毒—稀释血清的方法进行微量中和试验。

8操作步骤

8.1实验前准备

2

DB32/T3762.10—2020

8.1.1将实验所需细胞置37℃5%CO2培养箱培养至单层，在进入BSL-3接种病毒前，弃掉细胞培养

液，用Hanks溶液洗3次。

8.1.2配备消毒液：75%乙醇、有效氯5500mg/L的含氯消毒液。

8.1.3将细胞、病毒、血清、试剂和耗材一次性带入BSL-3核心区。

8.2血清稀释

8.2.1血清的处理：将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清56℃水浴灭活30min，为防止管盖

崩开，要用封口膜封管口。待冷却后移至生物安全柜内进行稀释。

8.2.2在生物安全柜里，将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清用DMEM维持液做倍比稀释，

使其稀释度分别为1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每管量为0.5ml。每一稀释度必须更

换吸头，吹打混匀。

8.3病毒稀释

在生物安全柜里，用DMEM维持液稀释病毒至100TCID50/0.1ml。

8.4血清与病毒结合

8.4.1在上述各稀释的血清管内加0.5ml病毒稀释液（100TCID50/0.1ml），充分混匀，拧紧管盖，

用封口膜封口后置37℃水浴1h。

8.4.2病毒对照为0.5ml病毒稀释液（100TCID50/0.1ml）加0.5ml的维持液，同样用封口膜封口后

置37℃水浴1h。

8.4.3正常细胞对照不加病毒，仅含DMEM维持液。

8.5接种细胞

8.5.1弃去细胞培养孔中的Hanks液。

8.5.2将每个稀释度的血清病毒混合物接种到单层细胞上，每一稀释度接种4孔，每孔0.2ml。

8.5.3将接种好样品的96孔培养板置37℃5%CO2培养箱中培养。

8.6结果观察

每24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（CPE），并记录结果，观察5d～7d，以0%～25%细胞

CPE变化为“+”，26%～50%细胞CPE变化为“++”，51%～75%细胞CPE变化为“+++”，76%～100%细胞

CPE变化为“++++”，正常细胞形态为“-”。以病毒对照出现“+++～++++”时，结束试验。

9结果判定

9.1质控要求

正常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现“+++～++++”的CPE变化；能够阻止产

生CPE的阳性对照血清可以中和病毒的感染性，故阳性对照血清孔应无CPE，与正常细胞对照孔相同；

阴性对照血清孔的CPE情况应与病毒对照孔相同。

9.250%血清中和终点的计算

50%血清中和终点为能保护50%细胞不产生病变的血清最高稀释度，即为中和终点，可按

Reed-Muench法计算结果，参见表1。

3

DB32/T3762.10—2020

表1某新型冠状病毒病人恢复期血清50%血清中和终点的计算

细胞

累计阳性

细胞病变管数病变分布

血清稀释度阳性率（%）

/总管数

（+）管（-）管（+）↓（-）↑比例

1:4（10-0.6)0/4040160/160

1:8(10-0.9)0/4040120/120

1:16(10-1.2)0/4