DB32T3788-2020梨枯梢病监测与检测技术规程

ICS65.020

B16

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3788—2020

梨枯梢病监测与检测技术规程

TechnicalspecificationformonitoringanddetectionofShootBlightofAsianpear

2020-04-08发布2020-05-15实施

江苏省市场监督管理局发布

梨枯梢病监测与检测技术规程

1范围

本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果

判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。

本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、砧木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T2292亚洲梨火疫病监测技术规范

SN/T1157进出境植物苗木检疫规程

SN/T1193基因分析检测实验室技术要求

3原理

梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.），是为害梨树的重要细菌病害之

一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和

分子生物学特征等进行监测与检测。

4试剂与材料

检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。

5仪器与用具

超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、

电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移

液器、制冰机等。

6监测技术

6.1监测植物

梨，主要监测亚洲梨。

1

6.2监测区域

重点监测亚洲梨集中种植区、引种繁育基地、苗木集散地等疫情发生高风险区。

6.3监测方法

6.3.1苗木监测

对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T1157要求进行抽样，并对样品进行

室内检测。

6.3.2田间监测

从梨树开花期开始，对当地农技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏

查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状（见附录B），如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样，

样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信

息进行记录（见附录C）。

在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7d调查一次。采用5

点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取

按照NY/T2292中的规定执行。

7检测技术

7.1样品处理

选择表现典型症状并带有菌脓的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取

病健交界处组织约（3mm～5mm）×（3mm～5mm），表面消毒和清洗后，在装有适量无菌水的离心

管中轻轻挤压，浸泡10min～30min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌脓并用无菌水清洗后制成样品

悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。

7.2检测方法

7.2.1显微镜检查

对于疑似症状的植物组织，切取病健交界处20mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低

倍显微镜下观察有无喷菌现象。

7.2.2培养特征检测

将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，28℃倒置培养24h～72h。在YPDA培养基平

板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征

以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录（参见附录B）。

7.2.3形态特征检测

按照常规染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭毛着生的位

置和数目、是否产生荚膜和芽胞、芽胞着生的部位和形状、细胞内含物等特征。

7.2.4致病性测定

2

取梨幼果（直径大约3cm～5cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置于垫有湿润的灭菌滤纸的培

养皿中。用无菌接种针蘸取培养24h～36h的菌落，针刺接种于幼果果肉组织，一个横切面接种3个～4

个点。接种后26℃保湿培养，24h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生和菌脓形成。以无菌水为对

照。

7.2.5ELISA检测

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液进行ELISA检测，检测程序参见附录D。如采用

商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。

7.2.6PCR检测

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测

程序见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。

8结果判定和报告

8.1结果判定

8.1.1症状识别判定

田间梨树发病症状符合附录B描述的梨枯梢病典型症状，判断为梨枯梢病。

8.1.2常规检测结果判定

镜检有菌溢现象；分离物形态特征和培养特性与梨枯梢病菌相符（参见附录B）；致病性测定可在

接种部位产生高度隆起的乳白色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭；能再次从接种发病部位分离到目

标病原菌，确定病原菌为梨枯梢病菌。

8.1.3ELISA检测结果判定

在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性

对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带梨枯梢

病菌。

8.1.4PCR检测结果判定

观察电泳结果，阳性对照在476bp处有条带出现，且阴性对照无条带，待测样品在476bp处有条带

出现，判断样品中含有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品中不带梨枯梢病菌。

8.2结果报告

8.2.1监测报告

记录监测结果并填写《疫情监测记录表》（见附录C）。对监测结果进行整理汇总，形成监测报告。

8.2.2检测报告

将实验室检测鉴定结果填入《植物有害生物样本检测报告》（见附录F）。

3

9样品、菌种保藏和无害化处理

9.1样品保藏

未发现梨枯梢病的样品保藏6个月，发现梨枯梢病的样品保藏1年，有贸易纠纷的样品保藏至少1年，

以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保藏到纠纷解决完毕。保藏样品要标明样品编号、样品名称、保藏人、

保藏日期和到期日期。样品保藏期满后，需经灭活销毁处理。

9.2菌种保藏

分离得到的梨枯梢病菌菌株应妥善保存，防止扩散。

9.3无害化处理

监测和检测过程中使用过的有关材料和用具，在使用完毕后须及时进行灭活销毁处理。

10疫情处置

经监测或室内检测发现梨枯梢病，应指导生产、销售和个人实施检疫处治及病害防治。

4

AA

附录A

（资料性附录）

试剂及培养基的配制方法

A.1ELISA检测

A.1.1包被液

Na2HCO32.93g、NaCl1.59g，用蒸馏水溶解，调整pH值到9.6，定容至1000mL。

A.1.2洗涤液

Na2HPO4·12H2O3.58g、KCl0.2g、KH2PO40.27g、NaCl8.01g、吐温-200.5g，用蒸馏水溶解，调

整pH值到7.4，定容至1000mL。

A.1.3样品提取液

Na2HPO4·12H2O3.58g、KCl0.2g、KH2PO40.27g、NaCl8.01g，用蒸馏水溶解，调整pH值到7.4，

定容至1000mL。

A.1.4封闭液

脱脂奶粉5g，溶解于100mL样品提取液。

A.1.5抗体稀释液

脱脂奶粉2.5g，溶解于100mL洗涤液。

A.1.6TMB显色液

A.1.6.1底物缓冲液

Na2HPO4·12H2O2.375g、柠檬酸1.1675g，用蒸馏水溶解，调整pH值到5.0，定容至250mL。

A.1.6.2TMB母液

10mgTMB溶于1mL二甲亚砜（DMSO）中，4℃保存。

A.1.6.30.75%H2O2

取25μL30%H2O2用超纯水定容到1mL，4℃避光保存。

A.1.6.4显色液

配置：在10mL底物缓冲液加入100μLTMB母液和32μL0.75%H2O2混匀后使用，需要现配现用。

A.1.7终止液

浓硫酸11.1mL，用蒸馏水定容到100mL。

5

A.2PCR检测

A.2.1电泳缓冲液TBE

Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA（pH8.0）20mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL。使用时利

用蒸馏水10倍稀释，即为0.5×TBE。

A.2.2琼脂糖凝胶

在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的琼脂糖，加热融化，冷却至60℃倒入插入梳子的制胶槽中，冷

却凝固后点样电泳。

A.2.3上样缓冲液

溴百里酚蓝0.025g，乙二醇3g，溶解于10mL蒸馏水。

A.3YPDA培养基

A液：聚蛋白胨20g，酵母提取物10g，溶解于850mL水中，121℃湿热灭菌20min；

B液：葡萄糖20g，溶解于100mL水中，115℃湿热灭菌15min；

C液：腺嘌呤硫酸盐20mg，溶解于10mL水中，115℃湿热灭菌15min；

将A、B、C三种溶液混合，用无菌水定容至1000mL。

如制作平板，在A溶液中加入15g琼脂粉。

6

BB

附录B

（资料性附录）

梨枯梢病基本信息

B.1分类地位

梨枯梢病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.）属于细菌界（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria），

γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae），

欧文氏菌属（Erwinia），在亚洲梨（Nashipear，Pyruspyrifolia）引起梨枯梢病，为亚洲梨树上的重要

检疫性病害。

B.2形态特征

革兰氏阴性菌，周生鞭毛，短杆状，兼性厌氧。菌体大小为0.8μm×（1.0μm～3.0μm），以单个、

成对或短链形式存在。

B.3生物学特性

病菌最适生长温度25℃～27.5℃。在YPDA培养基上28℃培养48h后，菌落大小直径为2mm，呈圆

形、白色、凸起、不透明。

B.4发病规律

病原菌在病树上越冬。翌年春天在潮湿环境中，病原菌活跃繁殖，可以通过蜜蜂、蚂蚁等昆虫粘带

传播，也可以通过雨水飞溅传播。病原菌通过花器、自然孔口（皮孔、气孔）或伤口侵入，在嫩枝中的

胞间或者导管中扩散。

B.5田间症状特征

B.5.1花簇与嫩枝

花簇上的症状一般在花瓣脱落1周～2周后表现。花器被害后呈萎蔫状，深褐色，并向下蔓延至花

柄，使花柄呈水渍状，然后皱缩变成黑褐色，脱落或干枯后仍悬挂在树枝上，花梗上有橘红色菌脓渗出。

嫩枝的症状与花期相似，但病害发展更快。嫩枝尖可迅速枯萎形成“牧羊鞭”状。感病叶片常发黑沿中

脉扩展至完全坏死。许多患病的嫩芽、梢和树叶，使一棵树看似被烧焦，枯萎。

B.5.2树干与枝条

新枝皮色变黑，水渍状，枝尖萎蔫下弯，呈“牧羊鞭”状；多年生枝中部皮层凹陷向前向后蔓延，

造成大枝、中心干整枝或整株死亡；枝条、骨干枝和主干表皮流出锈红色液体；拨开皮层韧皮、木质部

组织呈黄褐色。

7

B.5.3叶片

沿主脉或沿叶边缘及两脉之间形成黑褐色的病斑。随着变色加深，叶片卷曲萎缩下垂，干枯挂在枝

上不脱落，叶柄变黑，叶柄上有桔红色菌浓。

B.5.4果实

未成熟的果实受侵染时出现水渍状，然后呈褐色收缩，逐渐变黑，受侵染果实不易脱落。幼果出现

黑色斑点、斑块，局部或整个表皮先变黑，后延伸至果肉，果柄通常有菌脓；果实生长期间一直不断随

枝发病萎焉皱缩挂在树上失去商品性。

8

CC

附录C

（规范性附录）

疫情监测记录表

调查单位：调查时间：

编号作物品种调查地点调查株数疑似症状表现株数监测结果

调查人（签字）：

9

DD

附录D

（资料性附录）

梨枯梢病菌双抗ELISA检测程序

D.1包被

捕获抗体提前按照市售产品要求用包被液进行稀释，然后每孔加入100μL包被于96孔酶标板上。4℃

孵育12h～16h后弃去孔中液体，用洗涤液加满每个反应孔，静置1min～2min后，将洗涤液缓慢倒出，

重新加入新的洗涤液，重复上述步骤3次。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中

的水分。

D.2封闭

酶标板中每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1.5h后弃去封闭液，用洗涤液洗板3次，每次2min。洗

板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。

D.3加样

加入梯度稀释的梨枯梢病菌菌液，每孔100μL。室温孵育1h后弃去孔中液体，用洗涤液洗板4次，

每次2min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。

D.4加酶标检测抗体-HRP复合物

每孔加入100μL检测抗体-HRP复合物，抗体HRP复合物提前按照市售产品要求进行稀释，置于保

湿容器中，25℃孵育1h。用洗涤液洗板4次，每次2min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，

吸干反应孔中的水分。

D.5显色

提前15min配好显色液，每孔加入100μL，25℃避光显色20min至阳性对照显色。

D.6终止反应

显色后在每孔加入50μL终止液。

D.7测定

在波长450nm下用酶标仪测量结果，读取各孔溶液的光密度值（OD值），记录结果。

10

EE

附录E

（资料性附录）

梨枯梢病菌PCR检测程序

E.1DNA提取

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1mL菌悬液按照市售DNA提取试剂盒要求提

取DNA。提取后用蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量，当A260/A280比值为1.8～2.0时，适合于PCR扩增。

E.2引物

上游引物（HrcCF）:5’-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3’；

下游引物（HrcCR）:5’-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3’；

扩增产物为476bp。

E.3反应体系

见表E.1.

反应组成体积，μL

10×PCRbuffer5

25mmMgCl23

25mmdNTP2

引物（20μm）1

5U/μLTaqDNA聚合酶0.5

模板DNA2

ddH2O34

总体积50

E.4反应条件

94℃变性3min；进入循环，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延

伸5min。

如采用市售的试剂盒，按照说明作适当调整。

E.5电泳分析

取5μLPCR扩增产物与1μL的6×上样缓冲液混合均匀，上样于1.5%琼脂糖凝胶中，80V电泳1h，

溴化乙锭（EB）染色20min～30min后，凝胶成像系统中观察，记录观察结果。

11

FF

附录F

（规范性附录）

植物有害生物样本检测报告

植物名称品种名称

植物生育期样品数量取样部位

样品来源送检日期送检人

送检单位联系电话

检测方法：

检测结果：

备注：

检测人（签名）：

审核人（签名）：

检测单位盖章：

年月日

注：本单一式三份，检测单位、受检单位和检疫机构各一份。

12

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由江苏省农业科学院提出并归口。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准主要起草人：刘凤权、徐会永、赵杨扬、赵延存、孙伟波。

I

梨枯梢病监测与检测技术规程

1范围

本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果

判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。

本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、砧木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T2292亚洲梨火疫病监测技术规范

SN/T1157进出境植物苗木检疫规程

SN/T1193基因分析检测实验室技术要求

3原理

梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.），是为害梨树的重要细菌病害之

一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和

分子生物学特征等进行监测与检测。

4试剂与材料

检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。

5仪器与用具

超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、

电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移

液器、制冰机等。

6监测技术

6.1监测植物

梨，主要监测亚洲梨。

1

6.2监测区域

重点监测亚洲梨集中种植区、引种繁育基地、苗木集散地等疫情发生高风险区。

6.3监测方法

6.3.1苗木监测

对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T1157要求进行抽样，并对样品进行

室内检测。

6.3.2田间监测

从梨树开花期开始，对当地农技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏

查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状（见附录B），如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样，

样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信

息进行记录（见附录C）。

在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7d调查一次。采用5

点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取

按照NY/T2292中的规定执行。

7检测技术

7.1样品处理

选择表现典型症状并带有菌脓的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取

病健交界处组织约（3mm～5mm）×（3mm～5mm），表面消毒和清洗后，在装有适量无菌水的离心

管中轻轻挤压，浸泡10min～30min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌脓并用无菌水清洗后制成样品

悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。

7.2检测方法

7.2.1显微镜检查

对于疑似症状的植物组织，切取病健交界处20mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低

倍显微镜下观察有无喷菌现象。

7.2.2培养特征检测

将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，28℃倒置培养24h～72h。在YPDA培养基平

板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征

以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录（参见附录B）。

7.2.3形态特征检测

按照常规染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭毛着生的位

置和数目、是否产生荚膜和芽胞、芽胞着生的部位和形状、细胞内含物等特征。

7.2.4致病性测定

2

取梨幼果（直径大约3cm～5cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置于垫有湿润的灭菌滤纸的培

养皿中。用无菌接种针蘸取培养24h～36h的菌落，针刺接种于幼果果肉组织，一个横切面接种3个～4

个点。接种后26℃保湿培养，24h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生和菌脓形成。以无菌水为对

照。

7.2.5ELISA检测

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液进行ELISA检测，检测程序参见附录D。如采用

商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。

7.2.6PCR检测

挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测

程序见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。

8结果判定和报告

8.1结果判定

8.1.1症状识别判定

田间梨树发病症状符合附录B描述的梨枯梢病典型症状，判断为梨枯梢病。

8.1.2常规检测结果判定

镜检有菌溢现象；分离物形态特征和培养特性与梨枯梢病菌相符（参见附录B）；致病性测定可在

接种部位产生高度隆起的乳白色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭；能再次从接种发病部位分离到目

标病原菌，确定病原菌为梨枯梢病菌。

8.1.3ELISA检测结果判定

在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性

对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带梨枯梢

病菌。

8.1.4PCR检测结果判定

观察电泳结果，阳性对照在476bp处有条带出现，且阴性对照无条带，待测样品在476bp处有条带

出现，判断样品中含有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品中不带梨枯梢病菌。

8.2结果报告

8.2.1监测报告

记录监测结果