DB32T3925-2020白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增 (LAMP)检测技术规范

ICS65.150

B52

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3925—2020

白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增

(LAMP)检测技术规范

Technicalspecificationofdetectingwhite-spotsyndromevirus(WSSV)by

loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)

2020-12-15发布2021-01-15实施

江苏省市场监督管理局发布

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DB32/T3925—2020

白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范

1范围

本文件规定了用LAMP技术检测白斑综合征病毒的方法。

本文件适用于环介导等温扩增(LAMP)对虾、蟹白斑综合征病毒的鉴定及其检疫。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅改日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SC/T7103—2008水生动物产地检疫采样技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

环介导等温扩增Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)

一种新的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置

换DNA聚合酶在等温条件下保温30min-60min，所完成的核酸扩增反应。

4试剂和材料

4.1水

应符合GB/T6682中一级水的要求。

4.2模板制备缓冲液

缓冲液中含20mMTris-HCl，10mMKCl，体积百分数0.1%TritonX-100，10mM(NH4)2SO4，2mM

MgSO4，-20℃保存。

4.3BstDNA聚合酶

8U/μL，-20℃保存，不能在反复冻融或经历温度剧烈变化情况后使用。

4.4dNTPs混合物

含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5μmol/L的混合物，-20℃保存，不宜在反复冻融或温度剧烈

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DB32/T3925—2020

变化后使用。

4.5染色剂

10000×SYBRGreenI，-20℃避光保存。

4.6引物

检测所用4条引物，其序列如下:

F3：5′-GGTAAAGGAACGTTTTGTTG-3′

B3：5′-GCAATGGGAATGATAACTCTT-3′

FIP：5′-CGCATATTTCCCTCTATCGCTATTATTTTTTAGCACAGATTTTTTGAT-3′

BIP：5′-GGTCTGAAATATACATGGGTGCCTTTTTGAAAATGGGGTTTACGACAA-3′

4.7阳性对照

阳性对照为包括已知WSSVORF234片段的pET-28a(+)-234质粒，且PCR及LAMP检测结果为

阳性的质粒DNA模板。将提纯的pET-28a(+)-234质粒根据OD260吸光度值计算浓度，用TE缓冲液稀

释至150pg/μL，-20℃保存。

4.8阴性对照

阴性对照为不含WSSV基因的pET-28a(+)空载质粒，且LAMP检测结果为WSSV阴性的质粒DNA

模板。将提取pET-28a(+)空载质粒根据OD260吸光度值计算浓度，用TE稀释至150pg/μL，-20℃保存。

5主要仪器和设备

5.1高速冷冻离心机：最高转速可达15000r/min以上，配备能使用1.5mL离心管的转头。

5.2微量移液器。

5.3高精度恒温仪：控温精度±0.2℃。

5.4凝胶成像仪或紫外灯。

5.5水浴锅。

6操作步骤

6.1取样

待检的虾、蟹，如虾体长不超过2cm，取将整个虾去壳，虾体长超过2cm，取虾头部，去壳；蟹

体重不超过5g，取整个蟹，去壳，蟹体重超过5g，去壳，取组织肝胰腺、心、鳃组织。样品采集按

SC/T7103—2008中6.1的规定执行。

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DB32/T3925—2020

6.2制样

将待检新鲜组织0.2g，剪碎后研磨或进行组织匀浆至无明显组织块后置于1.5ml离心管内。加入

100μL模板制备缓冲液，沸水浴5min，12000r/min离心1min，上清转移至新的1.5ml离心管内，样

品应现制现测。

6.3LAMP扩增

按下表加入除了BstDNA聚合酶以外的各项试剂，配成无酶反应预混液。

表125μLLAMP扩增反应体系

试剂体积(μL)

10×反应缓冲液2.5

10μMdNTPs1

10μMFIP2

10μMBIP2

10μMF30.5

10μMB30.5

灭菌双蒸水14.5

6.4配制完全反应预混液

将无酶反应预混物单支分装到0.2mLPCR管中，保存于-20℃。在临用前，室温融解，按23μL

无酶反应预混液加1μLBstDNA聚合酶混匀，配制完全反应预混液。

6.5加样

按每管24μL完全反应预混液，分别在对应管中加入待检样品模板1μL、阳性对照

pET-28a(+)-234质粒1μL、阴性对照pET-28a(+)空载质粒1μL，混匀。

6.6孵育

将上述PCR管置于高精度恒温仪中，于63.0℃±0.2℃反应55min。

6.7染色

LAMP扩增反应结束后，取反应液1μL，加入到含有38μL无菌双蒸水、1μL100倍稀释的

10000×SYBRGreenI的200μLPCR管中，混匀后室温放置3min，置于紫外灯或凝胶成像仪下观

察，记录结果。

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DB32/T3925—2020

7结果判断

7.1LAMP扩增产物在紫外灯或凝胶成像仪下，阳性对照出现绿色荧光，阴性对照无绿色荧光，如待

测样品出现绿色荧光则判定为阳性。

7.2如阴性对照出现绿色荧光则判定为试剂或器械污染。

7.3如阳性对照没有出现绿色荧光则判定为试剂失效或仪器工作不正常。

白斑综合征病毒（WSSV）LAMP检测结果示意图参见附录B。

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附录A

(规范性)

试剂及其配制

A.1模板制备缓冲液

分别配制50mMTris-HCl，100mMKCl，50mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4的母液。

在46.9mL无菌双蒸水中分别加入40mLTris-HCl(50mM)、1mLKCl(100mM)、2mLNH4)2SO4(100

mM)、10mLMgSO4(2mM)、0.1mLTritonX-100混匀，4℃保存。

A.2SYBRGreenI

将10000×SYBRGreenI商品原液10μL与990μL无菌双蒸水混合，装在聚丙烯类管中4℃～8℃

密闭避光保存。2个月内使用有效。

A.3TE缓冲液（pH8.0）

取5mL初始浓度为1mol/L的Tris·Cl(pH8.0)和0.5mol/L的EDTA(pH8.0)1mL，向烧杯中加入

400mL双蒸水混合均匀，将溶液定容到500mL后高温高压灭菌，4℃～8℃保存。

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DB32/T3925—2020

附录B

(资料性)

白斑综合征病毒（WSSV）LAMP检测结果示意图

图B.1白斑综合征病毒（WSSV）LAMP检测结果示意图

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DB32/T3925—2020

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作到则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件的附录A、B为资料性附录。

本文件由苏州大学提出并归口。

本文件起草单位：苏州大学、江苏省水生动物疫病预防控制中心

本文件主要起草人：薛仁宇、贡成良、陈辉、曹广力、魏育红、方苹、胡小龙、朱敏、刘波。

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DB32/T3925—2020

白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范

1范围

本文件规定了用LAMP技术检测白斑综合征病毒的方法。

本文件适用于环介导等温扩增(LAMP)对虾、蟹白斑综合征病毒的鉴定及其检疫。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅改日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SC/T7103—2008水生动物产地检疫采样技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

环介导等温扩增Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)

一种新的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置

换DNA聚合酶在等温条件下保温30min-60min，所完成的核酸扩增反应。

4试剂和材料

4.1水

应符合GB/T6682中一级水的要求。

4.2模板制备缓冲液

缓冲液中含20mMTris-HCl，10mMKCl，体积百分数0.1%TritonX-100，10mM(NH4)2SO4，2mM

MgSO4，-20℃保存。

4.3BstDNA聚合酶

8U/μL，-20℃保存，不能在反复冻融或经历温度剧烈变化情况后使用。

4.4dNTPs混合物

含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5μmol/L的混合物，-20℃保存，不宜在反复冻融或温度剧烈

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DB32/T3925—2020

变化后使用。

4.5染色剂

10000×SYBRGreenI，-20℃避光保存。

4.6引物

检测所用4条引物，其序列如下:

F3：5′-GGTAAAGGAACGTTTTGTTG-3′

B3：5′-GCAATGGGAATGATAACTCTT-3′

FIP：5′-CGCATATTTCCCTCTATCGCTATTATTTTTTAGCACAGATTTTTTGAT-3′

BIP：5′-GGTCTGAAATATACATGGGTGCCTTTTTGAAAATGGGGTTTACGACAA-3′

4.7阳性对照

阳性对照为包括已知WSSVORF234片段的pET-28a(+)-234质粒，且PCR及LAMP检测结果为

阳性的质粒DNA模板。将提纯的pET-28a(+)-234质粒根据OD260吸光度值计算浓度，用TE缓冲液稀

释至150pg/μL，-20℃保存。

4.8阴性对照

阴性对照为不含WSSV基因的pET-28a(+)空载质粒，且LAMP检测结果为WSSV阴性的质粒DNA

模板。将提取pET-28a(+)空载质粒根据OD260吸光度值计算浓度，用TE稀释至150pg/μL，-20℃保存。

5主要仪器和设备

5.1高速冷冻离心机：最高转速可达15000r/min以上，配备能使用1.5mL离心管的转头。

5.2微量移液器。

5.3高精度恒温仪：控温精度±0.2℃。

5.4凝胶成像仪或紫外灯。

5.5水浴锅。

6操作步骤

6.1取样

待检的虾、蟹，如虾体长不超过2cm，取将整个虾去壳，虾体长超过2cm，取虾头部，去壳；蟹

体重不超过5g，取整个蟹，去壳，蟹体重超过5g，去壳，取组织肝胰腺、心、鳃组织。样品采集按

SC/T7103—2008中6.1的规定执行。

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DB32/T3925—2020

6.2制样

将待检新鲜组织0.2g，剪碎后研磨或进行组织匀浆至无明显组织块后置于1.5ml离心管内。加入

100μL模板制备缓冲液，沸水浴5min，12000r/min离心1min，上清转移至新的1.5ml离心管内，样

品应现制现测。

6.3LAMP扩增

按下表加入除了BstDNA聚合酶以外的各项试剂，配成无酶反应预混液。

表125μLLAMP扩增反应体系

试剂体积(μL)

10×反应缓冲液2.5

10μMdNTPs1

10μMFIP2

10μMBIP2

10μMF30.5

10μMB30.5

灭菌双蒸水14.5

6.4配制完全反应预混液

将无酶反应预混物单支分装到