浅谈蛋白质质谱分析

浅谈蛋白质质谱分析方法及应用董义龙(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景着出展望。关键词：蛋白质质谱分析原理与方法1蛋白质组学研究的背景和意义1．1蛋白质组学的产生20世纪90年代开始的人类基因组计划(}IumanGenomeProject，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(FunctionalGenomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。1．2蛋白质组学的概念“蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。这一术语一经提出，很快得到国际生物学界的广泛关注。第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第一部蛋白质组学专著。2000年三月首次发表了一个生物体的完整蛋白质组。2001年二月和同年六月分别公布了人类基因组框架图和序列图谱，极大地促进了蛋白质组学的兴起，成为后基因组计划的重要组成部分。1．3蛋白质组学研究的主要手段蛋白质组研究包括对蛋白质的表达模式的研究和对蛋白质功能模式研究的两个方面。它核心实验工具是双向凝胶电泳和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。蛋白质组分析首先要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质，目前一般采用1975年由‘Farrell等创立的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术pJ。双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化通过分析软件(如PDQUEST)可对数字化的图谱进行各种图像分析，包括分析蛋白质在图谱上的定位，分离蛋白质的计数，图谱间蛋白质差异表达的检测等。对分离出的蛋白质进行鉴定是蛋白质表达模式的又一重要内容。为适应大规模蛋白质组分析，质谱已成为蛋白质鉴定的核心技术。除此之外，还有Edman降解法测N端序列，氨基酸组成分析等。由这些技术测得的完整蛋白质分子量、蛋白质的肽指纹图谱以及部分肽序列等数据，通过相应的数据库的搜寻来鉴定蛋白质。生物信息学是蛋白质组学中的一个重要的技术平台，它研究生物信息的采集、加工、分析、存储和传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、工程科学以及生物学的技术、方法分析大量而复杂的生物学数据来揭示生物学的奥秘，是蛋白质组学中的不可或缺的一部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：…是构建和分析双向凝胶电泳图谱，二是数据库的搜索与构建。2质谱原理、发展及生物质谱技术2．1质谱及质谱分析的基本原理质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。[1,2]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。1）质谱分析蛋白的原理：质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。2）基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）简而言之，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比（M/Z）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。基质辅助激光解吸附质谱技术（MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。3）电喷雾电离质谱（ESI-MS）电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。笔者相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。但也要清醒地认识到，质谱的灵敏度虽然高，但仍然难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题，此外质谱的发展导致质谱仪价格非常昂贵。所以，需要积极地解决质谱自身发展的关键技术，才能使质谱在蛋白质分析中的作用更加的优化和凸显。化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：首先实现蛋白降解成多肽，通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（m/z值）的多肽离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的m/z值，分析鉴定未知蛋白质。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而备受科学家的广泛注意。5.1傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质分析中的应用传统上,蛋白质的鉴定是从头测序,多数是自动的逐步的化学降解(Edman降解)蛋白质,然后分离多肽片段。这些局部顺序依靠重叠的片段拼装组合出整个蛋白质的顺序,但是更多的用于探针从基因库分离出编码该蛋白的基因。随着序列数据库的增大,很明显,即使相对较短或不完善的序列(缺口,模糊的残基)对蛋白质的鉴定都是很有用的。当意识到质谱能比较理想的产生期望的数据时,用从蛋白质或多肽提取的信息和序列数据库相关联的方法,而不是从头测序进行蛋白质鉴定的观念已经逐渐地深入心5.2准确质量测定对蛋白质结构分析的应用价值氨基酸顺序测定的第一步就是蛋白质分子量的确定,这能为测定蛋白质分子中多肽链的数目和用质谱方法测定各个肽段的氨基酸顺序提供最基础的数据。质量准确性的提高不仅能提高数据库搜索的速度,还能大大提高鉴定的可信度。用丰度为99%的13C标记物培养基培养细菌,使磷脂中的12C被13C所取代,一旦C原子数已知,有n个碳原子质量数就会增加n,比较分别用ESIöFTöICRMS和(CID)FTöICRMS测得的天然和99%丰度的13C标记物培养基中磷脂的谱图,准确质量测定使其元素组成为唯一的可能。Demirev等组合使用完整蛋白质的准确质量测定和蛋白组数据库,显著提高了鉴定微生物的特异性。He等最近组合使用了高的磁场(9.4T),大的Penning阱的直径(101.6mm)及低的离子浓度,用L2ESIöFTöICRMS检测两种肽时质量分辨能力很高,这有可能成为蛋白组学研究的新突破点。ESIöFTöICRMS的准确质量测定还能可信的证实不确定的离子组成。5.3蛋白质分子中氨基酸序列的测定蛋白质一级结构测定的一个最灵敏和最普遍的方式就是先用二维聚乙酰胺凝胶电泳分离蛋白质混合物,以胰蛋白酶消解,质量分析(分辨和分离一个特别的肽段)并最终用质谱方法产生一个至少是部分的氨基酸一级结构。肽质量图谱(Peptidemassmapping)是蛋白质一级结构测定一种最常用的手段。肽质量图谱是基于序列特异性蛋白酶水解蛋白质衍生出来的肽的一个基团的准确质量的测定,是蛋白质鉴定的一个高效的方法。不同氨基酸序列的蛋白质用序列特异性的蛋白酶水解后将会产生一系列该蛋白独特的质量指纹。因此,如果用选择好的质量数(观察到的肽质量指纹)在一个包含有该特异蛋白的序列数据库中搜索,该蛋白就能依赖这个数据库正确的鉴定了。采用纳流量液相色谱与傅立叶变换2离子回旋共振质谱联用,提供了一系列的胰蛋白酶消解后的母离子和子离子的质量,质量的准确性达到了10-6数量级,从而进一步确证了人肝的三种二乙酰基还原酶。另外采用n2ESIöFTöICRMS在pmol数量级的灵敏度上获得了蛋白质消解物的准确的质量指纹图谱,缩小了数据库的搜索范围并降低了搜索的噪声,测得了该种乙醛氧化酶的序列。应用ESIöFTöICRMS和红外多光子解离(IRmultiphotondissociation,IRMPD)可对一种糖激酶进行分子量和肽的一级结构的精确测定。6高效液相色谱电喷雾质谱法用于茶多糖蛋白的纯度和相对分子质量的测定1）凝胶法：分别将已知的蓝色葡聚糖、葡聚糖-系列标准品（-.，-.，-.）溶解于蒸馏水中，质量浓度为GE6。上9#@0’4#$A凝胶柱，以1D*E6F’7*洗脱，流速16E13(，自动收集仪每13(收集管洗出液，并逐管检测（于(1检测多糖的蒽酮.硫酸衍生物），分别得到柱外体积（死体积）（用蓝色葡聚糖测得）和标样洗脱体积#（用-.测得）、#（用-.测得）、#（用-.测得）。以#E为纵坐标，*DG&为横坐标作图，得&标准曲线方程：#E,?*DG&然后以相同的条件将样品上柱，得到-A7，代入公式（中，求其&。2）5/67.89:.;9法：干燥气体流速6E13(，干燥气体温度J，雾化器压力K/’（@C3），毛细管电压=，质谱扫描范围。7液相色谱一质谱法比较分析正常人与胃癌患者的胃组织蛋白质7.1样品的制备样品为胃癌患者的胃组织，其中包含该患者正常的胃组织及癌症组织(术后病理学诊断为胃癌，病理分型均为低分化腺癌)。取材癌组织侵及胃壁全层，取癌组织中央坚硬部位(要求全层)，手术中无菌清理后，置于一80℃低温冰箱中保存待检。将正常胃组织与胃癌组织分别置于表面皿中并在冰上剪碎，用含0．0596吐温一20的pH7．4的0．01moL／L磷酸盐缓冲溶液(PBS)反复清洗直至清洗液为无色以去除残余的血液，以含1mmol／L蛋白酶抑制剂的8mol／L尿素溶液为蛋白质提取液进行冰上匀浆，然后在功率为85W时，工作10S，停止10S，循环超声5次条件下提取蛋白质。提取液于4℃、16000r／min下离心30min，取蛋白质溶液上清液，采用考马斯亮蓝(BRADFORD)法测定蛋白质浓度。蛋白质提取液经反相液相色谱分离，收集差异馏分并旋转蒸发浓缩至干，然后重新溶解于50mmol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)一HCI(pH8．3)中，按m(提取蛋白质)：m(胰蛋白酶)=50：1的比例加入胰蛋白酶，其中提取蛋白质质量由考马斯亮蓝法测定得到。于37℃摇床上反应24h，然后加1“L甲酸进行酸化终止反应，置于一20℃冰箱中保存备用。7.2RP-LC分离蛋白质提取液的条件预柱：自填装的C8反相硅胶柱(40mm×0．5mm，XBP填料，5ttm，孔径20nm，天津博纳司)；分析柱：反相有机聚合物色谱柱(250mm×4．6mm，5仙m，深圳纳微公司)。流动相A为含有0．1％三氟乙酸(TFA)的水溶液，流动相B为含有0．196TFA的乙腈溶液，流速为0．5mL／min；梯度洗脱程序：O一10min，296B一10％B；10—20min，10％B一35％B；20—55min，35％B一50％B；55—80min，50％B一80％B，保持20min。上样量：80斗g正常部分和癌症部分提取蛋白质。检测波长为214nm。7.3LC-MS／MS鉴定蛋白质提取物中差异蛋白质的条件LC条件：色谱柱为实验室自填充的C18反相微柱(5cmx300ttm，5灿m，孔径为20rim，天津博纳公司的填料)。流动相A为含2％乙腈和0．1％甲酸的水溶液，流动相B为含2％水和0．1％甲酸的乙腈溶液，流速5ttL／min；梯度洗脱程序：0—8min，O％B一10％B；8—20min，10％B一40％B；20．1min，80％B，保持10min。质谱条件：采集时间30min；扫描范围m／z400—2000；喷雾电压2．0kV；加热毛细管温度150℃；归一化碰撞能量设置为35％；在一级质谱扫描中选取信号最强的2个母离子进行串联质谱分析，其中动态排除重复2次，每次180s，重复容忍时间308。7.3蛋白质检索采用BioWorks软件通过Sequest算法检索数据库，数据库为安装Bioworks软件时自带的数据库。搜索结果按照如下参数筛选：当单电荷肽段的相似度指标五。值≥1．9；双电荷肽段的墨。。值≥2．2；三电荷肽段的墨。值≥3．75，并且当排名第一和第二肽段五。值的相对差值大于0．08时，认为检索结果为阳性。8结果与讨论8．1HPLC分离胃组织蛋白质提取物在相同的色谱条件下对人的正常胃组织和胃组织的蛋白质提取物进行分离，所得的谱图如图1所示。图l显示通过匀浆超声可以从胃组织中提取出大量的蛋白质。图l还显示了正常胃组织和胃癌组织的蛋白质组分在保留时间上的差异。分别收集保留时间为27～29min。45—47min，86～88rain馏分，并分别用胰蛋白酶酶解，然后进行LC-MS／MS鉴定。8．2差异蛋白质的LC·MS／MS鉴定收集差异最明显的一个时间段(保留时间为45—47min)的馏分，并经胰蛋白酶酶解，按照1．4节描述的条件进行LC-MS／MS鉴定。对正常胃组织及胃癌组织的蛋白质提取物色谱分离后收集的馏分分别作两次重复分析，其分析谱图如图2(正常组织)及图3(癌症组织)所示。对分析结果进行数据库检索，以两次分析均鉴定出的蛋白质作为鉴定结果，列于表1。裹1胃癌组织及正常胃组织差异部分共有及特异性蛋白质鉴定信息TableIIdentifiedcommonproteinsudspecificproteinsindifferentialcomponentsofhuronstomachtumortissueandnormaltissueNumbergiNumber‘plofproteinMrofproteinScoreSpecificproteinsintumortissuel45073598．5622476．670．2250304314．8241563．226．53176617045．4633923．0l