填料寿命研究指导

2020-08-20填料寿命研究指导 1一、层析填料寿命衰减的影响因素 2二、有效降低层析填料寿命的衰减 3三、层析填料寿命的界定 6四、层析填料寿命验证实验设计攻略 8五、层析填料寿命验证(重要) 9六、GMP审查中填料寿命验证之供应商审查 七、案例分享 汇总：孟旭1层析填料在生物药物生产中属于关键原材料。《中国药典》2015年版第三部《生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程》中，层析填料分类为第3级中等风险的原材料，需要进行相应的质量控制。近几年来，对层析填料的管理和验证已成为法规监管和现场核查的重点项目之一。《中国药典》2015年版第三部《人用重组单克隆抗体制品总论》则明确提出了要对纯化用材料(如层析柱填料)的重复使用的可接受程度进行验证，即层析填料的寿命验证。在ICH,FDA以及EMA的相关的法规中早已明确需要需要对层析填料的使用寿命进行验证。层析技术是生物制药下游工艺中的核心技术，在生物制药工艺中层析工艺占有较高的成本，生物制药下游工艺成本中层析工艺通常会高达60%以上，而层析填料作为层析过程的核心耗材，层析填料的使用寿命直接关系到整个层析工艺的成本。层析填料的重复使用可大大降低生产工艺成本，但同时层析填料的性能也会随着重复使用次数的增加而降低。层析填料的性能包括动态结合载量，回收率，对产品相关杂质和工艺相关杂质的去除率，以及层析介质自身属性(如配基密度，粒径分布，压力/流速曲线等)。层析填料性能的降低直接影响终产品药物的安全性和有效性。因此，从工艺成本和工艺性能的角度上，也需要对层析填料的使用寿命进行严格和科学的界定。那么我们如何有效的降低层析填料寿命的衰减呢?信息来源于网络，仅供大家参考学·!2一、层析填料寿命衰减的影响因素层析填料随着其重复的装柱，重复接触待纯化的样品，层析工艺过程的各种缓冲液，维护保养(再生，清洗CIP,消毒，保存)过程而使其动态载量及收率下降，非特异性吸附反压增大的变化导致的寿命衰减或者终止。层析填料寿命的衰减会影响整个工艺过程的成本，且衰减导致填料性能的变化而不能持续有效的满足工艺要求。层析填料寿命衰减因素分析：每次装柱的过程都涉及到填料的脱气处理，及装填柱床时的压缩柱床，然后脱气时的超声或者抽滤都会对填料施压，压缩柱床也要对填料施压，反复的施压及压力控制不当也会使填料的物理性能发生变化从而影响填料的寿命。每次装柱的过程都涉及到填料的脱气处理，及装填柱床时的压缩柱床，然后脱气时的超声或者抽滤都会对填料施压，压缩柱床也要对填料施压，反复的施压及压力控制不当也会使填料的物理性能发生变化从而影响填料的寿命。(柱床被严重污染或者进气泡时，拆装清洗比CIP效果更好，更有利于填料寿命衰减的降低)a.样品澄清度：样品越澄清对填料的寿命衰减影响越小。b.样品粘度：样品的粘度越小，对填料寿命的影响越小。c.样品酸碱度：过酸过碱都会加速填料寿命的衰减。d.样品离子强度：离子强度越高填料寿命衰减的越快。e.样品成分组成：样品成分越复杂，层析过程越复杂，填料的寿命衰减越快(这也与填料所处的工艺阶段吻合，捕获粗纯阶段填料寿命衰减的更快，精纯阶段填料寿命衰减的慢。)3.层析工艺a.柱床高度，流速及反压越大，工艺过程填料受到的外力就会增大，填料的寿命衰减就会增大。b.层析工艺过程的缓冲液的种类及洗脱的CV数也会影响填料的寿命，缓冲液越温和对填料寿命衰减影响越小，洗脱CV数越小对填料寿命衰减影响越小。3合理的维护保养过程可以降低填料寿命的衰减，但是维护过程的CIP及消毒过程通常都需要剧烈的条件，如强酸强碱等，所以CIP的强度及频率越大对填料的寿命衰减影响越大。a.再生：恢复介质原有功能b.清洗(CIP):去除填料中积累的杂质及污染物，比再生剧烈c.消毒：去内毒素及微生物d.保存：使用后合理保存(温度，保存液)二、有效降低层析填料寿命的衰减上面介绍了填料寿命衰减的影响因素，针对这些因素我们可以通过一些方式有效降低其对寿命衰减过程的影响。1填料的认知在层析工艺之前我们要对层析的耐压性，化学稳定性(如化学耐受性),物理稳定性(如压缩因子),保存条件，分离原理，材质做足够的认识，避免不合适的层析过程影响填料的寿命衰减(如IDA-Ni应避免接触氧化剂还原剂和螯合2样品的认知在层析工艺的时候我们要对我们的样品做足够的认知，包括样品的浓度，样品的组成等做一定的了解(如上游工艺，如真核细胞分泌表达的样品，要了解其上游工艺，培养基组成，培养过程等的一些添加剂是否对填料的性能及寿命衰减会有影响)。3样品的前处理a.样品中的颗粒物质在层析前要进行澄清处理，澄清处理的越彻底，对填料寿命衰减影响越小。b.样品的粘度要尽量小。c.样品的组份应满足层析工艺且对填料的性能没有影响，必要时可以用汇研生物的脱盐柱FocudexG-25柱对样品进行换液处理。4层析工艺4a.优化柱床高度使其既满足工艺指标，又可减少反压b.优化层析缓冲液使其对填料寿命衰减的影响最小(比如洗脱强度的合理温和可以降低配基的脱落和基质的老化)。c.优化层析过程减少非特异性吸附等也可以有效降低填料寿命的衰减过程。5维护保养不同的介质及不同的污染物清洗方法不同，清洗纪要保证清洗效果同时要减少对层析介质的损伤，还要避免清洗试剂对介质的二次污染，选择合适的清洗方法非常重要。依据层析介质的污染物的种类进行清洗方法，下面分别介绍不同污染物清洗方法的选择。清洗是去除再生没有去除的污染物，那么我们就要了解污染物的来源，污染物与物料及工艺阶段，工艺过程联系紧密。1)捕获阶段，物料通常比较复杂，含有大量的杂质，色素，内素素等，再生往往难以去除干净，那么待清洗去除的物质也很复杂，清洗过程也很复杂，可能需要多种模式配合作用，同时清洗的频率和强度都要高。通常使用1个循环后就要清洗一次。2)中度纯化阶段，物料已经去除了大部分杂质，通过再生残留在介质上的污染物就很少了，清洗过程和频率比捕获阶段就要低很多。使用5-10个循环后就需要清洗一次。3)精纯阶段，物料已很纯净，只含有微量的杂质，再生通常就可以达到清洗的目的，此时清洗的频率和强度就更低。根据小试确定的清洗需要开始的状态进行清洗。a可溶性杂蛋白的清洗可溶杂蛋白主要是HCP,可溶性杂蛋白主要是由介质的非特异性吸附或者洗脱强度过低引起的，这个在我们再生的时候通常已经去除干净，若介质被可溶性杂蛋白污染，再生和清洗的过程往往可以合并为一步。1)离子交换介质用2M的氯化钠洗1-2CV,接触时间控制在15-30min,若清洗完保存，则需要用10mM氢氧化钠或者20%的乙醇流经柱床即可。2)疏水层析被可溶性蛋白污染时，可用低浓度缓冲或者超纯水，或者30%的异丙醇清洗2-3CV即可，53)凝胶过滤介质被可溶性杂蛋白污染时，可用2M的氯化钠或者0.1-0.5M的氢氧化钠清洗1CV即可。4)亲和层析被可溶性蛋白污染时，清洗要一句亲和层析的类型进行选择。层析介质被可溶性蛋白污染时清洗过程可和再生过程合二为一同时进行。b固化的蛋白(沉淀或聚集)的清洗固化在介质中的蛋白，是介质在使用的过程中，蛋白变性后沉淀在介质，也有可能是介质使用时介质中高密度蛋白聚集而成沉淀(这与物料的性质有关)。固化在介质中的蛋白严重影响介质的性能，要及时清洗。1)凝胶过滤介质，疏水介质，离子交换介质通常都可以通过0.5-1M的氢氧化钠进行清洗1-2CV即可，清洗完后要立即用水清洗到中性。2)亲和介质的种类多，亲和介质被沉淀的蛋白污染时要依据亲和介质的种类及耐受性选择合适的清洗方法，部分可通过尿素或等蛋白变性剂清洗1-2CV.c疏水性蛋白的清洗疏水性蛋白污染介质时，离子交换介质，疏水介质，凝胶过滤介质用3-4M的氢氧化钠清洗3-4CV,然后立即用水洗到中性。亲和层析介质则要根据其种类选择合适的方法清洗。d脂类物质的清洗等非离子型去污剂清洗3-4CV,或者30%异丙醇及70%e核酸的清洗用1M氯化钠加1M氢氧化钠清洗1-2CV,亲和层析介质需要摸索清洗方法。f色素的清洗色素是一类物质，不同来源的色素的清洗过程差异较大，可根据介质的性质及色素的性质进行清洗，碱洗，酸洗，有机溶剂，及去污剂，变性剂都可以尝试。g内毒素及微生物的清洗内素素及微生物的清洗通常用0.5-1M的氢氧化钠清洗1-2CV之后，在用超纯水冲洗至中性。亲和层析介质可通过0.5%的非离子型去污剂及有机溶剂的方式清洗内毒素。清洗过程注意事项：61)清洗过程要综合考虑污染物的类型及介质的种类，清洗时要减少对介质2)清洗时通常需要多种方法组合使用，清洗过程并非是固定不变的。3)清洗试剂应选择纯度高的试剂，避免二次污染。4)清洗之后要立即洗到中性保存。5)清洗状态的确定及方法的确定要结合整个工艺过程。6)清洗之后要对清洗过程进行验证，保证清洗目的实现，可通过测定载量，流速等介质的性能指标验证。6层析设备的选择层析柱的分布器，清洗死角，密封性，材质也会影响层析填料的寿命。三、层析填料寿命的界定层析填料寿命的界定通常指在特定工艺条件下使用过程中，从开始使用到使用时与设定的工艺指标发生偏差的使用次数。1、工艺指标与填料指标-目标产品：纯度，收率-杂质性质：含量，种类-层析过程：色谱曲线，载量，反压等1.2填料性能：-清洗后性能恢复2层析填料寿命验证的进行2.1评价参数层析填料寿命验证的评价参数主要包括以下四个方面(1)层析填料和层析柱相关指标：柱效(HETP和As),压力/流速性质，层析填料配基密度等；7(2)层析行为相关指标：UV,pH和电导层析图谱，层析收集液体积；(3)产品评价相关指标：包括产品的收率，纯化，产品相关杂质以及工艺相关杂质的残留，污染物(微生物和内毒素)的残留等；(4)空白运行：相关杂质的残留(Carryover);2.2分析方法对2.1中的评价参数需要建立相应的分析方法。此时的分析方法已经完成了相应的方法学验证，并且是商业化生产时所用的方法。常用的分析方法见表1。评价参数层析柱评价参数HETP和As柱效测定(UNICORN)压力/流速曲线压力/流速曲线测定(UNICQRN)层析介质特性DBC,配基密度，粒径分布层析行为评价参数层析图谱层析图谱叠加分析(UNICORN)产品评价参数收率蛋白浓度分析(A280)纯度(分子量，电荷)SEC-HPLC,GC-HPLC,IEC-HPLC,SDS,iCIEF相关杂质ELISA(HCP,proteinA),qPCR(DNA)等其他空白运行层析图谱，蛋白浓度，SDS并不是所有循环次数的样品都要进行全检，如表2所示，可以每隔N次的留样样品进行全检，其余的循环次数的样品可进行简单的检测，比如层析图谱，蛋白浓度，SDS等。空白运行的样品可只进行相应杂质残留的检测。但是，每个循环次数的样品都要留样，留样体积及其保存温度可参考表3。表2留样样品的分析方法循环次数收率图谱ProteinA每隔N次TTTTTTT空白运行TTTNTNTNTNT所有次数TTNTNTNTNTNT8留样体积保存温度A280ProteinA2.4接受标准层析填料寿命终结的标准可以有两种定义，一是可以直接设置一个极限数值，比如收率小于90%,纯度低于95%或者HCP含量高于某一个特定的数值。二是可以采用统计学的方法，当评价参数发生统计学意义上的趋势改变时，设定为填料的寿命终结。层析技术是生物制药下游工艺中的核心技术，在生物制药工艺中层析工艺占有较高的成本，生物制药下游工艺成本中层析工艺通常会高达60%以上，而层析填料作为层析过程的核心耗材，层析填料的使用寿命直接关系到整个层析工艺的成本。如何设计层析填料寿命验证的实验呢?1、填料寿命验证的理论依据：层析介质的寿命界定是通过使用过程工艺指标的偏差去判断的，那么验证寿命就是使用过程偏差发生之前的使用过程的积累。验证是通过小试实验数据的积累统计分析去完成的。小试验证实验是为中试及生产提供可靠的依据，在设计小试实验时，就要明确层析过程线性放大的各种因素及对层析过程有影响的各种因素，综合层析过程放大因素及层析过程影响因素来设计小试验证实验。【层析过程放大因素】91)须保持一致的因素：柱床高度，层析柱及层析系统类型，线性流速，样品状态及属性，层析过程(平衡，清洗，洗脱体积数及缓冲液种类),清洗试剂2)可线性放大因素：体积流速，柱床体积。【层析过程影响因素】环境温度对层析过程有一定影响，特别在疏水层析过程中，环境因素对层环境洁净程度对层析过程，特别是精纯阶段及去内毒素时影响很大。人为因素，最难控的因素对层析过程的影响也很大。建立SOP及有效可靠的过程监控方法是避免人为因素对层析过程的稳定可靠的一种方式。【寿命验证小试实验设计】1)在设计小试验证实验时需保证层析过程放大因素和中试及生产规模保持一致的因素完全一致，可根据层析过程中的可线性放大因素设计试验规模及层析2)避免层析过程影响因素对结果的影响。设计小试实验室必须在生产所要求的环境温度及洁净车间进行，并且严格执行过程SOP,且要对过程进行可靠3、填料寿命验证实验设计寿命验证实验设计必须能够完全反映商业化生产规模的性能，寿命验证实验必要要商业化生产规模之间的相关性。寿命验证要能完全反应规模化生产的性能，故而寿命验证实验的设计要能够实现工业化放大，寿命验证实验是将工业生产工艺在一定比例(1:1000-1:100000)上进行实验验证。五、层析填料寿命验证(重要)寿命验证实验设计必须能够完全反映商业化生产规模的性能，寿命验证实验必要体现商业化生产规模之间的相关性。1.寿命验证实验需和工业生产一致的因素a.柱床高度b.线性流速c.填料型号d.样品在柱床中的保留时间e.样品的状态及属性(浓度，组成，前处理工艺)f.层析过程(平衡，上样，清洗，洗脱CV数及缓冲液种类)g.清洗试剂的种类及清洗过程h.环境温度2.寿命验证和工业生产可线性缩小的因素a.柱床体积b.层析柱直径c.体积流速e.层析体积(平衡，清洗，上样，洗脱体积)3.需注意事项a.柱效b.柱壁效应c.设备放大管路及检测器检测范围和灵敏度差异4.寿命验证实验的验证a.色谱峰的峰形(UV,pH及电导)b.产品收率c.产品纯度d.产品含量(洗脱浓度及总量)e.杂质(种类及含量)六、GMP审查中填料寿命验证之供应商审查中供应商审查都审查什么呢?而是一类标准的统称。是由TC176(TC176指质量管理体系技术委员会)制定的所有国际标准，是ISO12000多个标准中最畅销、最普遍的产品。SO9001质量管理体系不仅为我们提供了一套具有科学性的质量管理和质量保证方法及手段，提高了我们内部管理水平，使得内部各类人员的职责明确，办公效率高。其中文件化的管理体系更是使全部质量工作都有可知性、可见性和可查性。使员工更理解质量的重要性及工作的规范性，为客户和潜在的客户提供信心。在提高企业的形象，增加竞争的实力，满足市场准入的要求上具有很重要的制定法规支持文件(RSF)的先驱，向客户提供有关工艺层析介质的性能、稳定性、可析出化合物，以及分析方法的详细信息。这些文件内的信息是