白藜芦醇对神经母细胞瘤SH-SY5Y增值和凋亡的影响

白藜芦醇对神经母细胞瘤SH-SY5Y

增值和凋亡的影响

一、立项依据（项目的意义、前期工作及现状分析）：白藜芦醇(Resveratro，Res)化学名称为3,5,4-三羟基苯二烯，对植物本身具有保护作用。20世纪90年代后，白藜芦醇的药用价值得到人们的注意。大量研究显示，白藜芦醇具有多种生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、心血管保护与延缓衰老以及抗神经损伤和促进神经修复等作用作用。在白藜芦醇药用价值发现的同时，其生物学效应的研究也在广泛开展。大量实验表明，白藜芦醇对人和动物多种细胞的生物活性具有高度的浓度双向依赖性效应，即在低浓度下表现为促进细胞增殖；而在高浓度下，特别是对于多种肿瘤细胞，表现为抑制细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。白藜芦醇的促进细胞增殖和抑制增殖、诱导细胞凋亡的效应对不同细胞具有不同的浓度范围。

在促进细胞生长、存活和抗氧化损伤研究方面，有研究认为，白藜芦醇发挥了植物雌激素样作用，具有强抗氧化剂的效应，能使氧化应激中的细胞减少过氧化氢的产生，恢复谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性，进而抑制活性氧产生，清除氧自由基，抵抗由于氧化和氧自由基过度产生所导致的DNA损伤。在白藜芦醇的抗神经损伤实验中发现，损伤神经元内Bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）表达量升高且Bax（bcl－2associatedxprotein）表达量下降，从而抑制细胞凋亡，其中白藜芦醇还抑制了DNA的合成，使细胞周期停留于S期，促进其DNA有充足的时间得以修复，从而起到神经组织的保护作用。另有研究表明白藜芦醇还起到对细胞周期的调节作用。目前报道中，白藜芦醇对胃癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、脑胶质瘤、神经母细胞瘤等细胞均有显著的抑制作用，且该作用发挥于肿瘤的起始、促进和发展的三个阶段。高浓度的白藜芦醇同样可以调节Bcl-2/Bax通路，但使得肿瘤细胞的Bcl-2的表达下调，从而促进了bax的表达，而诱导了凋亡的发生。同时还发现，白藜芦醇的肿瘤抑制作用与其对肿瘤细胞K+、Ca2+离子通道调节有关，即促进Ca2+细胞内流而引起凋亡。Survivin是凋亡抑制家族中的一员，可在肿瘤细胞、胎盘和未分化的一些组织中高表达，使细胞逃避凋亡。白藜芦醇则能通过抑制前列腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞内Survivin表达，从而促进肿瘤细胞凋亡进程。综上所述，白藜芦醇对多种细胞的生物学效应具有显著的双向浓度依赖性效应，尽管在不同研究中运用了不同浓度范围白藜芦醇作用于多种细胞，但表现出的细胞效应均与细胞周期、细胞凋亡的调控相关。SH-SY5Y是一个来自于人类的多巴胺能的神经母细胞瘤,是研究药物抗肿瘤作用的重要细胞模型。因此，本研究以其为研究对象，通过探讨白藜芦醇在不同浓度下对SH-SY5Y细胞增殖与细胞周期的影响及变化规律，为进一步研究该物质对多巴胺类神经母细胞瘤的作用机制和开发利用其生物学效应提供依据。同时对于白藜芦醇的药用价值的发挥和临床应用提供了重要的基础。

参考文献：[1]周福成,周艳琴,郭婷婷,等.白藜芦醇的研究进展[J].中国医药导报,2009,6(8):11-13.[2]周海斌.白藜芦醇促进成骨细胞分化的机制研究[D].山东济南：山东大学，2008.[3]周杰,雷鹏,张翔,等.白藜芦醇对大鼠创伤后伤区神经细胞凋亡的影响[J].创伤外科杂志,2008,10(1):20-24.[4]夏志平,郑航,彭伟.白藜芦醇对前列腺癌PC-12细胞Bcl-2和Survivin表达的影响[J].医学新知杂志,2009,19(2):98-100.[5]张生军,刘敏丽,魏晓丽,等.白藜芦醇对人胃癌细胞凋亡及其与Survivin蛋白表达的影响[J].中国现代医学杂志,2009,19(2):270-273.[6]张黎,李勇,周畅,等.白藜芦醇对人胰腺癌细胞Capan-1增殖和细胞周期的影响[J].实用医学杂志,2010,26(1):14-16.[7]张黎,李勇,张洁,等.白藜芦醇对小鼠胚胎成纤维细胞增殖和细胞周期的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(12):1109-1111.[8]李运红，陈敏，邹晓平，等.白藜芦醇对胃腺癌细胞株增殖和凋亡的影响[J].南京医科大学学报（自然科学版）,2011,31(8):1192-1195.二、项目实施方案、实施计划和可行性分析：实施方案1.SH-SY5Y的培养将SH-SY5Y培养于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养液中，置于含有5％CO2的细胞培养箱中于37℃静置培养。待细胞生长至近融合状态时，用含EDTA的0.25％胰酶消化传代，每3d传1代，将对数生长期的细胞用于下述试验。2.药物处理与分组将白藜芦醇用含有0.5%DMSO（二甲基亚砜）的血清培养基助溶,Res处理组:设0.5，5，50，150，500μmol/L浓度组；对照组：培养液中含有0.5%的DMSO；空白对照组：细胞培养体不加任何处理，作为整体实验对照。3.不同浓度白藜芦醇对SH-SY5Y细胞增殖的影响

收集对数期细胞，并进行一系列的处理，接种细胞于96孔培养板中,每孔加入100μL，设对照组及空白对照组。并放入含有5%CO2的细胞培养箱中于37℃静置培养。经过24h后，往各孔内加入100μL含药培养基,于37℃、5%的CO2饱和湿度条件下培养,各组分别于白藜芦醇刺激2d后收集细胞检测，每组设5个复孔。于实验终止前4h加入MTT溶液50μL/孔，4h后弃上清，加入150μLDMSO，振荡15min后，于酶标仪上测定490nmOD值。另用细胞板,接种0d时细胞数量,测定其OD值。计算增值率。同时，根据所得细胞增殖率绘制增殖曲线。4、SH-SY5Y凋亡细胞形态的荧光显微镜观察

收集对数生长期的SH-SY5Y细胞,以104个/mL的密度接种于6孔培养板中,每孔3mL，设空白对照组，于37℃、5%的CO2饱和湿度条件下培养,24h后往各孔内加入含药培养基,使得每孔溶液中含药最终浓度符合“药物处理与分组”部分设计的浓度要求，于37℃、5%的CO2饱和湿度条件下培养,各组分别于白藜芦醇刺激2d后,按照细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒说明进行染色和荧光显微照相分析。5.SH-SY5Y细胞周期的流式细胞仪检测

收集对数生长期的SH-SY5Y细胞,以106个/mL接种于六孔板中，每孔3mL，于37℃、5%的CO2饱和湿度条件下培养,24h后往各孔内加入含药培养基,使得每孔溶液中含药最终浓度符合“药物处理与分组”部分设计的浓度要求，设立对照组，各组分别于白藜芦醇刺激2d后,利用PI单染色法进行流式细胞仪检测，分析细胞周期，记录各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。实施计划2012年4月-2012年5月实验准备，查阅资料2012年5月-2012年7月SH-SY5Y细胞的培养和预实验阶段，熟练实验技术2012年8月-2013年2月实验研究阶段（1）不同浓度白藜芦醇对SH-SY5Y细胞增殖的影响实验（2）SH-SY5Y凋亡细胞形态的荧光显微镜观察（3）不同浓度白藜芦醇对SH-SY5Y细胞周期及凋亡的影响实验2013年2月-2013年4月实验收尾、数据统计分析，完成结题。可行性分析本研究所用神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞是肿瘤学研究应用较为普遍的细胞模型，培养条件和方法成熟，成为较好的试验对象。在研究中所涉及的主要试验方法包括：MTT法检测细胞增殖率、流式细胞术、荧光显微镜观察，均为目前生命科学研究较为成熟的试验手段，确保了所获得的试验数据的准确性和方案运作的可行性。从试验设计上看，已有大量的报道证实了白藜芦醇对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响具有浓度依赖性，即低浓度促进生长，高浓度抑制生长和促进细胞凋亡作用。这为本研究所探讨的白藜芦醇浓度依赖性作用提供了可行性依据。此外，本小组成员具有良好的生物学基础，已经具备了一定的生物学实验技术，而且有长期从事科学实验研究老师为我们项目的顺利开展提供指导。因此，本研究立论依据充分，试验设计合理，试验手段客观，且科研人才有保障，实施本次创新实验可行。三、创新点简介本研究将白藜芦醇低浓度促进细胞增殖和高浓度抑制、杀伤细胞的双向浓度依赖性相结合，通过分析白藜芦醇在不同浓度下对SH-SY5Y细胞增殖与细胞周期的影响及变化规律，为初步研究白藜芦醇对多巴胺类神经母细胞瘤的作用机制和有开发利用其生物学效应提供依据。同时对于白藜芦醇的药