斑马鱼atlastin蛋白通过BMP信号通路抑制运动及脊索运动神经元轴突的形成

斑马鱼atlastin蛋白通过抑制BMP信号通路控制运动及脊索运动神经元轴突的形成为了更好地理解遗传性痉挛性截瘫(HSP),我们研究了atlastin的功能——该蛋白常参与青少年时期发病的HSP,使用的方法为分析atlastin的基因(atll)敲除后导致幼鱼运动能力严重下降(先于脊索运动神经元轴突形成异常)并伴有BMP信号通路明显上调。过表达物阻断BMP信号可以充分拯救atll吗啉反义寡核苷酸(MO)注射调了保持BMP信号的平衡对脊椎动物运动神经元轴突的形成和稳定在神经系统中神经元之间联系的发生取决于生长的轴突找到的合适的靶点(常常位于较远距离上)的能力。在神经系统的发生中，和无脊椎动物的多种细胞中。三种主要的内分泌的形态发生因子，BMP、Wnt和Hedgehog家族在胚胎发生的早期决定了沿躯体轴线分经发育晚期轴突的生长。特别是BMP分子还参与了线虫和果蝇的运动神经元轴突的引导和神经肌肉接头(NMJ)的形成。最近在无脊椎动物中进行的研究发现了BMP信号通路和影响上/下运动神经元轴突的神经退行性疾病之间的联系。遗传性痉挛性截瘫(HSP),肌萎缩性侧索硬化症和脊髓性肌萎缩症的果蝇模型表明果蝇体内的相关致病基因的产物干扰了NMJ处的BMP信号。的表型变异和遗传异质性。到目前为止已经发现了超过40个HSP位点和21个痉挛性截瘫基因(SPGs)。尽管这21种SPG基因编码的蛋性遗传的HSP(AD-HSP)的一个主要致病位点，在所有的AD-HSP家族中占10%。ATL1编码atlastin(亦称atlastin-1),分子量64-kDa,马和锥体神经元中含量丰富。到目前为止，已报道了ATL1的38种突变体，大多数通过单倍剂量不足引起早发的纯AD-HSP,但也有突变体可导致三种复杂的AD-HSP和痉挛性脑瘫。Atlastin是一种多聚网marker分子之间，以及沿着大鼠胚胎皮层神经些成熟的神经细胞中将Atl-1knockdown后会削弱轴突生长和神经轴与融合。但究竟是那种机制是引起HSP的病因目前尚不清楚，为了研究atlastin在脊椎动物中的功能，我们在斑马中使用了loss-和gain-of-function分析。我们分离出斑马鱼的atllcDNA,确定了它在胚胎发生时期的表达模式，用反义吗啉寡核苷酸进行了knockdown实验。Atlastin敲除后导致斑马鱼幼鱼运动能力严重丧失，伴有脊髓运动神经元轴突分叉增多。我们用人的受体的转运来抑制BMP信号通路。最后，在胚胎发育晚期，敲除后可以通过在受体水平用遗传学方法或药物阻断BMP通路进行拯救，这进一步确定了BMP信号通路在HSP发生过程中的病理生结果斑马鱼atlastin的鉴定和表达情况我们使用BLAST搜索斑马鱼基因组数据库并找出源的斑马鱼atl1基因。斑马鱼的这一基因由13个外显子组成，编码一个含562个氨基酸的蛋白质，与人类的相比表现出较高的保守性(77%一致，90%相似；补充图1)。用原位杂交的方法，我们检测了在体节发育后期atllmRNA的表达情况(图1a),尽管蛋白印迹分析表明在囊胚期中期已有存在(图1b和补充图2),提示这种蛋白在斑马鱼中是母系表达。我是指那些在神经管(包括从原始端脑到脊髓末端)中的进行有丝分裂较高，在发育的大脑中分布广泛(图1a)。在发育的脊索中，atl1在不同的神经元中表达水平不同，包括有丝分裂后的初级运动神经元 Atlastin敲除后的解剖和行为表型为了研究atlastin-1在斑马鱼发育中的功能，我们用反义吗啉寡核苷酸(MO,包括2种阻断翻译的靶向MO,其中一个阻断atll第8外显子和第8内含子之间的剪接位点)干扰其翻译。每种MO注射相同的浓度，结果在注射过的胚胎(n>300)中85-90%出现了可重复射过MO的胚胎的水平显著降低(图1c和补充图2)。在2细胞和4细胞期注射0.2-0.3pmol的atllMO的胚胎与未注射的胚胎和注射了5-bp对照MO的胚胎相比发育正常。由于脊索有丝分裂后力明显下降(图2a和补充视频1)。与对照组胚胎触碰后的反应相比，MO胚胎运动明显减慢，游泳距离较短(图2b,c)。接下来我们用拯救实验评估了这种运动能力的丧失是否是由于atlastin-1的缺失所特与MO在1细胞期共注射，在受精72小时后(hourpostfertilizationhpf)分析胚胎的运动行为。人或斑马鱼atlastin-1的表达对幼鱼的运动能力有完全的拯救(图2和补充视频1),这证明MO组游泳能力为了探明运动缺陷的原因，我们用运动神经元轴突标记物znpl经元轴突进行免疫组化实验(图3a,b)。用znp1标记的58-hpf的MO胚胎免疫组化结果显示脊索运动神经元轴突(SMNs)走行的路径异常且沿着轴突伴有多个异常分叉(每次试验中n=20-25,重复3在拯救的胚胎中明显减少(图3c)。反过来，用乙酰化MO组SMN轴突末端缺乏稳定的微管。Atl1敲除不仅导致56-58hpf胚胎向腹侧投射的次级运动神经元大量分叉，也导致24hpf初级运动神经元异常分支，然而功能性的神经肌肉突触的形成只有轻微的改变，正如神经末梢位置乙酰胆碱受体的积累所示(n=31;补充图3)。另外，90%的次级运动神经元不能向嘴端投射，64%的运动神经元轴突在水平的肌节处异常成束，30%的MO幼鱼出现异常的脊索运动神经元轴突发出位点(n=30;补充图3)。究了SMN轴突的异常结构是否是脊索神经元形成过程中受到影响的结果。在22hpf的对照组和MO组胚胎中用泛神经markerHuC/D的抗体进行免疫组化，没有表现出明显的不同(每组胚胎数n=25;补充表4)。同样的，比较在体节发生时期MO组和对照组脊索腹侧整个区域的运动神经元前体的少突胶质细胞转录因子-2(olig2)的表达量没有表现出不同(每组n=10,补充图4)。然而，atl1MO组有丝常定位(n=12/25;补充图4)及22hpf胚胎脊索尾端腹侧运动神经元的不规则分布(n=20/25;补充图4),这提示MO组神经元的早期迁移及定位方面有缺陷。随后我们用抗磷酸-H3和蛋白酶3的抗体进行对照组胚胎之间并未发现任何明显的变化(补充图5)。为了判断atl1敲除是否导致其它神经细胞的缺陷，我们用另外的抗体和转基因品系对MO组进行了研究。用3A10的抗体(特异性标记Mauthner纤维)对MO组和对照组幼鱼进行免疫组化实验，结果未显示任何明显的不同(图3d)。同样的，用鳃运动神经元，Rohon-Bread感觉神经元和脊索GABA能中间神经元的特异性marker标记也没有在MO组和对照组胚胎之间表现出任何差异(补充图6,atllMO组中小脑组织出现明显缺陷(n=37/62;图3b)。运动能力缺失的关系。我们用移植的方法制作带有Hb9-GFP标签的大多数的在脊索腹侧的运动神经元缺乏运动能力受限(n=62/77),运动情况与atllMO组的运动表型极其相似(图4b,c及补充视频2)。同样在嵌合胚胎中出现SMN异常分支(图4d)。这表明注射MO后的运动能力丧失涉及SMNs。Atlastin抑制BMP信号通路胚胎1细胞期过表达人或斑马鱼的atlastin-1。所有注射了30-50pg人ATL1或斑马鱼atllmRNA的胚胎表现出腹鳍缺失的表型(n=100;图5a),这让人联想到与BMP信号突变有关。增加atll的浓度 (80-100pg)可引起更严重的表型：50%注射后的胚胎表现为腹部结突变的胚胎中过表达atll是否可以缓解上述腹部表型。注射atllmRNA到1细胞期的chordino'胚胎中可部分拯救躯干突变表型，所有注射的胚胎伴有腹侧血岛的积累减少(n=57;图5,6)。我们检测了在原肠胚形成期是否atl1的过表达会下调BMP信号分子，如磷酸化5d)。在60%外包期，与对照组相比(n=38),注射了atll的胚胎有93%出现了P-Smad1/5/8的明显下调(n=40,图5c),在80%外包期(图5d)与对照组胚胎(n=146)相比，atl1过表达的胚胎有70%出现了GATA3表达区域的明显减少。最后，过表达一种断裂atllmRNA(atlastin有GTP酶活性的区域缺失)不会产生异常表型，这提示组P-Smad1/5/8水平明显上升(图6a,b及补充图2,7)。在atll过表 (补充图7)。我们又在MO组蛋白提取物中检测到BMPI型受体的含量明显上升(图6a,b和补充图2)。为了更好地表明MO组中BMP信号的上调，我们取24hpfMO组和对照组胚胎的脊索神经元进行原代培养，用免疫组化的方法对BMP通路中不同分子的含量和定位进组神经元中P-Smad1/5/8的含量明显增加(2802.9±44.4AFU;P<0.0001),这证明atlastin抑制了BMP信号。为了解atlastin在斑马鱼中的亚细胞定位，我们用prim-5期胚胎的原代培养的脊索神经元进行免疫组化分析。在斑马鱼脊索神经元中，atlastin-1呈点状分布于胞体和突起内的囊泡状结构上。这些atlastin(+)的囊泡沿着突起均匀的分布，在生长锥中的含量尤其丰Rab4和Rab7共定位(补充图8)。我们又研究了的BMP信号组分共定位，发现在脊髓神经元中均与分布的晚期内体中，30%有atlastin与BMP受体I的部分共定位(图7a,b)。这一结果结合atllMO组中BMP受体I的水平升高(图6a),提示atlastin通过调节BMP受体的转运来抑制BMP信号。这与另一种HSP蛋白由于atlastin与内质网膜的融合有关，我们猜想是否atl1敲除会影响体内膜的组分。然而MO组脊索神经元(n=100)和成纤维细胞(n=100)与对照组相比并未发现早/晚期内体形态学和分布上有明显的改变(补充图9)。通过抑制BMP信号拯救atlastin表型为研究atlMO组的运动及SMN表型是否是由BMP信号的上调引起的，我们检测了是否抑制BMP通路可以缓和MO组的表型。用系表达一种显性负性作用的BMP受体I(DN-BMPRI),其表达受热休克诱导启动子的控制。我们将MO组及对照组胚胎各分出一半在32-36hpf时热休克处理，然后在72hpf用为尾部触碰反应评价这四种胚胎的运动能力。经热休克处理的atl1MO(DN-BMPRI)组幼鱼超过90%表现出与经同样处理的对照组幼鱼相似的正常运动能力，而(图8a-c及补充视频3)。与注射了atl1mRNA的MO组胚胎一样，MO(DN-BMPRI)组胚胎通过抑制BMP信号而得到完全拯救(补充视频1和3)。我们接下来用抗乙酰化a-tubulin及znp1的抗体，用免疫组化的方法研究了56hpf的各组(DN-BMPRI)胚胎SMN轴突的情况。热休克处理的MO(DN-BMPRI)组与对照组相比SMN轴突正常。相反，未处理MO(DN-BMPRI)组胚胎出现异常的SMN进行免疫组化实验发现轴突断裂且难以观轴突断端(图8e,f)。在每组胚胎中，我们各选12个，每个胚胎选择肛门部位的8个体节对轴突断端及分支情况进行计数。热休克MO组(DN-BMPRI)与未处理MO组比较，断端及分支数目明显减少 (P<0.001,t检验)。但与热休克处理的对照组胚胎(DN-BMPRI)为了研究BMP信号在斑马鱼SMN发育中的作用，我们用dorsomorphin(一种可使BMP受体失活的小分子)处理MO组及对照组胚胎以阻断BMP通路。MO组及对照各分成3组，在16-18体或DMSO处理的MO组胚胎表现为明显的运动能力丧失(补充表2)。这表明阻断BMP信号通路可完全拯救atl1MO表型，说明BMP信BMP信号在果蝇运动神经元的发育过程中特异性的参与轴突运输及微管网络的组织。然而，直到现在尚未发现BMP信号通路在脊椎动种敲除后的表型可以通过下调BMP信号来拯救。我们的发