克隆基因的表达与纯化

2第七章 克隆基因的表达原核大肠杆菌噬菌体系统真核酵母昆虫细胞哺乳动物细胞系动、植物病毒系统植物、动物个体（转基因）1克隆基因的表达与纯化5/8/2024第一节 外源基因在原核细胞中的表达用原核生物作宿主一、原核生物基因表达的特点1.只有一种RNA多聚酶识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。2.以操纵子为单位数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。3.转录和翻译偶联、连续进行。2克隆基因的表达与纯化5/8/20244.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。6.mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（SD）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。3克隆基因的表达与纯化5/8/20244二、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子。2.必须用cDNA3.不能直接用真核基因组DNA。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。三、原核生物基因表达的调控1. 启动子是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。（1）启动子序列大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。-35Box和-10Box克隆基因的表达与纯化5/8/2024consensus sequences5克隆基因的表达与纯化5/8/2024①-35boxRNA聚合酶

亚基的识别位点。5’-TTGACA-3’②-10box（PribnowBox）5’-TATAAT-3’原核启动子共有序列的功能6克隆基因的表达与纯化5/8/2024补充材料7克隆基因的表达与纯化5/8/20248克隆基因的表达与纯化5/8/2024（2）翻译的起始位点核糖体结合位点（RBS）ribosomebindingsite1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体小亚基16sRNA结合的序列。SD序列距离AUG的距离也影响翻译2）起始密码：位于SD序列下游约7个碱基处。AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）9UAAGGAGGU克隆基因的表达与纯化5/8/20243.转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。原因：①茎环结构反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作用②多聚A/U由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。10克隆基因的表达与纯化5/8/2024125-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)11克隆基因的表达与纯化5/8/202412克隆基因的表达与纯化5/8/202413克隆基因的表达与纯化5/8/2024144.翻译终止密码大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）5.翻译增强子 Translationenhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。6. 基因工程常用的原核启动子（1）最佳启动子必须具备的条件①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。克隆基因的表达与纯化5/8/202415克隆基因的表达与纯化5/8/2024（2）乳糖启动子lac来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。16克隆基因的表达与纯化5/8/2024IPTG=异丙基硫代-β-D半乳糖IPTG有毒、昂贵，不理想。17克隆基因的表达与纯化5/8/202418克隆基因的表达与纯化5/8/202419克隆基因的表达与纯化5/8/202420克隆基因的表达与纯化5/8/202421克隆基因的表达与纯化5/8/202422四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达（1）包涵体（inclusionbody）①优点使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞②缺点回收的蛋白生物活性差,经过复杂的变复性,得率较低。例：在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子克隆基因的表达与纯化5/8/202423克隆基因的表达与纯化5/8/202424克隆基因的表达与纯化5/8/202425克隆基因的表达与纯化5/8/20242007-1-4352.周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。（2）信号肽（signalpeptide）能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等②金黄色葡萄球菌的蛋白A。（４）真核信号肽也能在细菌中起作用。一般位于N端。（3）常用的原核信号肽①大肠杆菌的信号肽：鼠源RNase、人生长激素信号肽。26克隆基因的表达与纯化5/8/20243.胞外表达使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。27克隆基因的表达与纯化5/8/202428克隆基因的表达与纯化5/8/202429克隆基因的表达与纯化5/8/202430克隆基因的表达与纯化5/8/2024除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白3.融合蛋白表达载体系统----pGEX系列31克隆基因的表达与纯化5/8/2024便于融合蛋白的分离和纯化。（1）优点（2）组成结构①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI ④S-D序列⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）（3）产物提纯GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。32克隆基因的表达与纯化5/8/2024（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。33克隆基因的表达与纯化5/8/202434克隆基因的表达与纯化5/8/202435克隆基因的表达与纯化5/8/202456（5）其他融合蛋白系统His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。人胰岛素在大肠杆菌中的表达Cyanogenbromide：溴化氰36克隆基因的表达与纯化5/8/2024

6Z系列载体：提供三种融合插入阅读框。（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变也减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。37克隆基因的表达与纯化5/8/202438七、提高表达水平常用的方法1.选择强启动子序列，如tac等2.调整S-D序列与AUG碱的距离 一般为5-9bp。距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子能提高翻译的起始效率。4.增加mRNA的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’

5’外切酶的攻击。5.减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系（1）诱导表达将宿主生长代谢与外源基因表达分开。一般采用温度诱导或药物诱导。克隆基因的表达与纯化5/8/2024

PL启动子是温度诱导型32°C:cI857阻遏物有活性，抑制

PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。42°