基因工程及分子标记育种

第三节基因工程及分子标记育种学习要点：基因工程的含义、原理和方法基因工程在育种上的应用分子标记及其在育种上的应用1基因工程及分子标记育种5/8/2024一、基因工程的基本概念原理和方法（一）基因工程的含义将具有遗传信息的DNA片段，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的受体中进行复制和表达的技术。2基因工程及分子标记育种5/8/20241、DNA的结构和性质（1）A、T、G、C。（2）DNA合成以5’-3’方向发生，半保留复制。（3）DNA的变性、复性、杂交。2、RNA的结构和性质（1）碱基：A、U、G、C。（2）细胞中含有3种RNA：tRNA、rRNA、mRNA。（二）基因工程的分子生物学基础3基因工程及分子标记育种5/8/20243、真核基因转录有关的结构与类型（1）启动子（promoter）基因转录起始所必需的一段DNA序列，启动子本身不被转录。启动子成分主要由帽子位点、TATA盒（转录起点上游TATAAATA）、CAAT盒（转录起点上游GGTCAATCT）、GC盒（转录起点上游CCGCCC）等组成。启动子的分类：组成型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子4基因工程及分子标记育种5/8/2024（2）内含子和外显子

mRNA的剪接（splicing）现象：转录形成的mRNA前体（pre-mRNA）在作为蛋白质的合成模板之前，非编码序列会被删除而成为成熟RNA。将基因中对应于成熟mRNA中尚存部分的DNA序列称为外显子（exon），对应于被切除的部分称为内含子（intron）。5基因工程及分子标记育种5/8/2024（3）终止子（terminator）转录终止子：基因编码区下游的可被RNA聚合酶识别和停止合成RNA的一段DNA序列。（4）增强子（enhancer）许多真核生物启动子的转录可被远离转录起始位点数千个碱基调控元件所增强，这一调控元件称为增强子。（5）沉默子（silencer）在基因内能抑制基因表达的DNA序列称为沉默子，又称为减弱子或抑制子。6基因工程及分子标记育种5/8/20244、基因的不同区域及其作用（1）基因的功能结构和分区①5’上游区②5’非翻译区③编码区④3’非翻译区7基因工程及分子标记育种5/8/20245、基因的表达与调控（1）基因的表达中心法则：转录：在基因表达过程中，DNA分子通过指导合成一条互补的RNA链，从而拷贝了自身的信息，这个过程称为转录（transcription）.翻译：由RNA指导合成多肽，其产物的氨基酸序列由RNA的碱基序列决定，这个过程称为翻译。8基因工程及分子标记育种5/8/2024（三）基因工程基本技术1、核酸分离（1）DNA的分离：CTAB法提取植物基因组DNA（2）RNA的分离（3）DNA及RNA含量的测定、纯度和质量的评定理想的A260/A280应为1.8，若样品中有蛋白质或多酚类物质污染时，则明显低于1.8；采用琼脂糖凝胶电泳结合Southern杂交等方法可检验基因组DNA质量。9基因工程及分子标记育种5/8/2024测定RNA于260nm，280nm和230nm处的吸光值。理想的A260/A230应大于为2.01000bp-500bp--28S-18S-5S改良的CTAB法提取的野百合基因组DNA芥菜RNA10基因工程及分子标记育种5/8/20242.分子杂交分子杂交包括核酸分子杂交和蛋白质杂交。核酸分子杂交分为Southern和Northern杂交。Southern杂交是指特异性探针结合的是基因组DNA；而Northern杂交特异性结合的是RNA分子。蛋白质分子杂交称为Western杂交。利用抗体抗原的特异性结合来检测蛋白质与蛋白质分子相互作用。11基因工程及分子标记育种5/8/20243.PCR技术聚合酶链式反应（1）PCR的基本原理及影响因素（2）RT-PCR

逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）以RNA为起始模板，在逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）作用下，逆转录产生cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，从而获取目的基因或检测基因表达的方法。12基因工程及分子标记育种5/8/2024（四）基因工程基本步骤与方法1.基因克隆策略（1）基因克隆第一：获得DNA片段；第二：将DNA片段连接到载体上；第三：将包含外源DNA片段的载体导入到宿主细胞；宿主大多是大肠杆菌。第四：重组体的筛选。

13基因工程及分子标记育种5/8/2024基于基因功能的克隆法①根据基因表达的蛋白质；②根据基因的表型突变互补功能；基于遗传图谱的克隆方法基于差异表达的克隆方法①差示技术；②代表性差异分析；③竞争杂交；④抑制性差减杂交；⑤交互式差异RNA技术2.基因分离14基因工程及分子标记育种5/8/2024（4）DNA插入的克隆方法（5）缩减杂交法（6）基于随机cDNA测序的克隆法（7）PCR扩增法（8）同源序列法3.重组体DNA分子的构建4.重组体分子导入受体细胞转化：宿主细胞直接吸收外源质粒DNA分子，并获得某些新遗传性状的过程。15基因工程及分子标记育种5/8/2024（1）插入失活（2）核酸杂交法原位杂交和分子杂交（3）免疫学筛选5.重组体分子的筛选16基因工程及分子标记育种5/8/2024（五）遗传转化植物基因工程载体按用途可分为克隆载体、表达载体、转化载体三类。17基因工程及分子标记育种5/8/2024（六）基因工程在园艺植物遗传改良中的应用1.基因工程在育种中的应用（1）改良品质（2）提高抗病虫能力（3）改善抗逆性（4）提高光合作用和固氮效率（5）创建雄性不育材料（6）延缓果实成熟（7）选育抗除草剂品种（8）改变花色、花形、花香18基因工程及分子标记育种5/8/20242.存在的问题及展望（1）转基因植物的安全性评价和环境释放问题（2）转基因植物的安全性问题（3）知识产权与商品化发展问题（4）未来发展19基因工程及分子标记育种5/8/2024二、分子标记技术1.分子标记的概述（1）多态性与分子标记每个DNA分子的碱基顺序构成了DNA分子的特异性，不同的DNA链编码出完全不同的多肽链。

DNA多态性（polymorphism）是描述DNA分子变异大小的一个术语，用以描述生物的遗传变异。在遗传育种研究中，每个与性状或目的基因连锁的多态位点称为一个分子标记。20基因工程及分子标记育种5/8/2024（2）分子标记的优点直接以DNA形式表现，稳定。数量多，遍布整个基因组。多态性高。不影响目标性状的表达。能鉴别纯合基因型或杂合基因型。21基因工程及分子标记育种5/8/20242.几种DNA分子标记

RFLPRAPDSSRAFLPISSR22基因工程及分子标记育种5/8/20243.DNA分子标记的种类依据对DNA多态性的检验手段，DNA分子标记可分为四大类：第一类：基于DNA-DNA杂交的DNA标记。主要包括RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段长度多态性）和VNTR(variablenumberoftandemrepeat,可变数量串联重复)标记。23基因工程及分子标记育种5/8/2024第二类：基于PCR的DNA标记。根据所用引物的特点，分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。前者包括RAPD（rapidamplifiedDNApolymorphism,随即扩增DNA多态性）标记和ISSR（intersimplesequencerepeats,简单重复序列间标记）标记等。后者包括SSR标记、SCAR（sequencecharacterizedamplifiedregion）标记、STS（sequencetaggedsite）标记等。24基因工程及分子标记育种5/8/2024第三类：基于PCR技术与限制性酶切技术结合的DNA标记。可分为两类：一种是先将样品DNA用限制性内切酶进行酶切，再对其酶切片断进行选择性扩增，检测扩增的限制性片断的长度多态性，称为AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片断长度多态性）标记。另一种是先对样品DNA进行专化性扩增，再用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，检测被扩增片断的多态性，称为CAPS（cleavedamplifiedpolymorphicsequence）标记。25基因工程及分子标记育种5/8/2024第四类：基于单核苷酸多态性的DNA标记，即SNP标记。它是DNA序列中因单个碱基变异而引起的遗传多样性。目前SNP一般通过DNA芯片技术进行分析。26基因工程及分子标记育种5/8/20244.常用分子标记的原理及实验技术（1）RAPD标记①技术原理

10寡核苷酸为引物，对部分DNA序列进行随机扩增，只有当模板DNA链不太长（≤2000bp）的区域内存在2个与随机引物反向互补（基本或完全互补）的序列时，这一段DNA才能被扩增。

RAPD与常规PCR的不同之处：1.引物短，10寡核苷酸单链；2.一个引物，起两个引物的作用；3.退火温度较低（35-40℃），以利于多态性的检出。27基因工程及分子标记育种5/8/2024Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。②基本技术及影响因素PCR反应程序：

Step194℃5minStep294℃30sStep336℃30sStep472℃1min30sStep5Gotostep240cyclesStep672℃7minStep74℃end28基因工程及分子标记育种5/8/20243000bp

M1234565000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMg2+浓度对RAPD扩增结果的影响注：1～6分别为1.5、2.0、2.25、2.5、3.0、3.5(mmol/L)29基因工程及分子标记育种5/8/2024过高的dNTPs

浓度会同Taq

DNA聚合酶竞争Mg2+，使Mg2+总量下降，抑制Taq

DNA聚合酶的活性，同时也会使错误率大大增加，浓度太低会使PCR产物减少。100bp250bp500bp2000bp1000bp5000bp

M1234563000bpdNTPs浓度对RAPD扩增结果的影响注：1～6分别为0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05(mmol/L)750bp30基因工程及分子标记育种5/8/2024TaqDNA聚合酶含量过高时会有小片段产生，呈现弥散状态。TaqDNA聚合酶含量过低则导致扩增条带太弱。500bp750bp1000bp2000bp5000bp3000bpTaq酶用量对RAPD扩增结果的影响注：1～6分别为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5(U)M12345631基因工程及分子标记育种5/8/2024DNA模板浓度低于一定范围时分子的碰撞几率降低，偶然性大，扩增产物不稳定；浓度太高又会造成模板DNA浪费还会使非特异性增加。100bp250bp500bp1000bp2000bp3000bp

M1234565000bp750bpDNA模板用量对RAPD扩增结果的影响注：1～6分别为10、20、40、60、80、100(ng)32基因工程及分子标记育种5/8/2024引物浓度过低，无法与所有的模板DNA结合位点结合，导致扩增结果不理想，引物浓度过高时，会促使引物错误地引导非特异性产物的合成。

M123456250bp2000bp100bp500bp750bp1000bp5000bp3000bp引物用量对RAPD扩增结果的影响注：1～6分别为5、7.5、10、12.5、15、20(pmol)33基因工程及分子标记育种5/8/2024引物S263对28份观赏南瓜种质扩增的RAPD带型注：从左到右依次为Marke