芽孢杆菌用于防治大口黑鲈嗜水气单胞菌病的测试

大口黑鲈（Micropterussalmoides），又称加州鲈，是我国重要的淡水经济鱼类。在养殖过程中，嗜水气单胞菌常诱发大口黑鲈出现“肠道感染、出血、溃烂”等症状，严重时还会导致大口黑鲈出现大规模的死亡，带来巨大的经济损失。通常人们会使用抗生素对细菌病进行治疗。但是长期使用也促使了耐药菌出现，导致菌群平衡失调等。益生菌在近几年逐渐走入大众视野。目前可以将益生菌大致分为四类，分别是乳杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、链球菌等。其中的芽孢杆菌是一类可以产生芽孢的革兰氏阳性菌，能够耐酸碱、高温等恶劣条件，具备明显的生存优势，芽孢杆菌产生的芽孢可以在胃内酸性条件下存活，从而经过胃到达于小肠，在其中发挥益生作用，可以有效应对病害的发生，因此被认为是水产养殖业中的潜在益生菌。本测试从大口黑鲈肠道中选择芽孢杆菌作为拮抗嗜水气单胞菌的益生菌，这是区别于传统药物使用的一种防治方法，具备新颖的应用研究视角。一

测试方法本次实验所需的大口黑鲈样品从广州市番禺区某养殖场采集，鱼体规格100~200g；指示菌种：嗜水气单胞菌，由华南农业大学海洋学院提供。首先选取10组患病塘，采集健康及患病的大口黑鲈各5组，每组采集6尾大口黑鲈，共采集60份样本；然后取出肠道，无菌条件下置于冰盒保存。最后将部分样品混合。委托广东美格基因科技有限公司对样品进行高通量测序。分析比较健康与发病的样本肠道菌群差异，发现益生菌。二

测试结果健康组与患病组的大口黑鲈的肠道内容物中的细菌种类存在差异，其中芽孢杆菌的差异最为显著，在健康鱼肠道内容物中芽孢杆菌属（Bacillusspp.）丰度较高。1.细菌分离及鉴定结果经划线纯化，共分离出6株潜在的芽孢杆菌，均为革兰氏阳性菌，呈杆状，长短不一。2.贝莱斯芽孢杆菌抑菌结果在大口黑鲈肠道内分离出的6种芽孢杆菌中（如图1），4种对嗜水气单胞菌的生长无明显抑制作用，1种有抑制作用但效果不明显，1种贝莱斯芽孢杆菌的抑菌效果最为显著。图16株芽孢杆菌对嗜水气单胞菌的抑菌结果3.攻毒实验结果连续21d对大口黑鲈进行饲喂实验，记录每日大口黑鲈的存活情况，绘制Kaplan-Meier生存曲线，如图2所示。图2大口黑鲈Kaplan-Meier生存曲线（CK组：不攻毒，投喂普通饲料；A组：攻毒，投喂拌有贝莱斯芽孢杆菌发酵液的饲料；B组：攻毒，投喂普通饲料。）其中对照组（CK组）的大口黑鲈无死亡情况；对实验组（A组）的大口黑鲈投喂普通饲料并浸泡攻毒，累计死亡率为82.5%；对实验组（B组）的大口黑鲈投喂拌有贝莱斯芽孢杆菌菌液的饲料并浸泡攻毒，累计死亡率为62.5%，同A组的死亡率相比下降了20.0%；贝莱斯芽孢杆菌对大口黑鲈的保护率为24.2%。由此得出，在人工感染的过程中，将贝莱斯芽孢杆菌拌料投喂大口黑鲈可以延缓大口黑鲈的死亡，并降低大口黑鲈的死亡率。三

讨论与分析1.益生菌的选择芽孢杆菌能够通过形成芽孢应对恶劣环境，在水产动物肠道内存在时间较长，相较于其他益生菌能够更大限度的发挥益生作用，符合筛选要求。结合实验的实际情况及高通量测序结果，最终确定将芽孢杆菌作为分离对象。此外，从肠道中分离芽孢杆菌优于从外部水体环境直接筛选。目前使用的芽孢杆菌是经外源添加而非鱼体本身具有的，其能否稳定存在于肠道发挥作用以及安全性尚不清楚。从肠道中分离出的芽孢杆菌，侧面反映出了该种芽孢杆菌能够在肠道中存在，并在自然情况下不会对大口黑鲈造成损害。2.高通量测序分析对健康组和患病组大口黑鲈肠道细菌展开差异性和菌群组成的分析。发现芽孢杆菌存在于健康组大口黑鲈的肠道中，并且芽孢杆菌的相对丰度在健康组和患病组中存在明显差异，健康大口黑鲈的肠道中存在更多数量的芽孢杆菌。由此可以推断芽孢杆菌有可能是大口黑鲈的肠道益生菌，在延缓大口黑鲈发病中发挥作用。3.攻毒试验评估为更好模拟养殖过程，本动物实验采用的浸泡攻毒是慢性攻毒，同注射攻毒相比，试验周期较长，前期的致死效果不明显。但浸泡攻毒9d后出现效果，初期大口黑鲈开始死亡，中期连续多日死亡量陡增，后期趋于平稳，该现象与养殖过程中疫病爆发过程类似。在注射后的1d，A、B两组均有大口黑鲈死亡。但死亡个体为群体中较小者，可能是鱼体自身免疫力较低，未对菌液浸泡的环境适应。对于整个实验过程和结果而言，未产生明显不良影响。本次体外攻毒实验通过模拟养殖环境，再次验证了贝莱斯芽孢杆菌的益生效果，但仍存在一些不足之处：如仅通过死亡率判断贝莱斯芽孢杆菌所发挥作用，并未对大口黑鲈肠道微生物的数量及组成进行再次统计和分析判断。四

结果与实际意义本研究借助高通量测序分析不同健康状况的大口黑鲈肠道微生物差异。先从患病塘口的健康大口黑鲈肠道内筛选、分离出9株细菌；再经菌落形态观察、革兰氏染色初步判定以及16SrRNA测序鉴定出6株芽孢杆菌，其中的YB-9为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis），对嗜水气单胞菌的拮抗效果最为明显。发酵培养后用菌液拌料连续10d饲喂大口黑鲈，发现该菌不会对大口黑鲈的健康造成不良影响；最后进行攻毒实验，实验结果对生产指导意义：一是将贝莱斯芽孢杆菌添加于饲料饲喂大口黑鲈有一定的保护效果，保护率可达24.2%。二是养殖实际过程中应注意要预先拌料投喂，建立起肠道益生菌的保护屏障，实现病害防控。因在实验过程中笔者发现浸泡感染嗜水气单胞菌后的6-7d，实验组的大口黑鲈开始出现“吃料慢