绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告

绿色荧光蛋白基因克隆及表达1绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024研究背景PART012绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024GFP的应用主要集中在利用其荧光性质的基础上作为一种标记物。GFP近几年得到了广泛的应用与发展,成为各研究领域的宠儿,但由于基础理论研究远不及应用研究,因而其存在着一些问题与不足。3绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024研究绿色荧光蛋白(GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入大肠杆菌体内,通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。4绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024实验技术路线图PART025绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024菌株培养28a切胶回收质粒提取DH5αPEGFP-N3BamH1Not1电泳检测质粒PEGFP-N3质粒提取DH5αPET-28a质粒PET-28aGFP连接28a醋酸铵法检测合格GFP醋酸钠沉淀法回收6绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024转化重组质粒酶切鉴定菌落PCR鉴定抗性筛选质粒PET-28-GFP转化BL-21PET-28-GFP

诱导表达

检测得到发光的GFP蛋白DH5α感受态细胞质粒PET-28-GFPBL-21PET-28-GFP7绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024实验材料和方法PART038绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024耗材：5ml塑料离心管20个,塑料离心管架(30孔)1个,10、100、1000μL微量加样器各一支,三角瓶300ml一个,100ml一个及塑料滴管1个,微型瞬间离心管,加样器及吸头,经高压灭菌的Eppendorf管,电泳槽,样品槽模板(梳子),有机玻璃内槽,橡皮膏,锥形瓶(100mL或50mL),玻璃纸,一次性塑料手套,PCR反应小管,离心管架,玻璃平皿,生化培养箱各类枪头,离心管,PCR管,离心机仪器：台式高速离心机SGMA1-13一台,台式Beckman高速冷冻离心机一台,制冰机,高速冷冻离心机,恒温摇床,电热恒温培养箱,无菌操作超净台,电热恒温水浴,分光光度计,台式高速离心机,台式高速冷冻离心机,电泳仪、PCR仪，紫外凝胶成像系统,微量移液器、微量取液器，台式高速离心机,瞬时离心机,琼脂糖平板电泳装置及电泳仪，恒温水浴锅,电热恒温培养箱,无菌工作台,凝胶成像系统,

PCR仪,电泳仪。实验材料9绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024大肠杆菌DH5α，含有pEGFP质粒的DH6α菌株、含有pET-28a（+）质粒的DH5α菌株、空载的DH5α和BL21（DE3）菌株。用3~4ml汉Kan+抗性的LB液体培养基培养含有pEGFP质粒的DH5α菌和含有pET-28a（+）质粒的DH5α菌BamHⅠ和NotⅠ酶，T4噬菌体，DNA连接酶，限制性内切酶BufferK。实验材料10绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024溶液1－G.E.T缓冲液（pH8.0），溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS，溶液3－乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)，灭菌蒸馏水，pH7.5~8.0醋酸铵（NH4Ac）7.5mol/L，异丙醇，70％乙醇，无水乙醇，0.5×TBE缓冲液，平衡液BL，溶胶液PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，0.1mol/LCaCl2溶液，卡那霉素100mg/ml，IPTG，2KBDNAMaker，6XLoadingBuffer，酶反应终止液(10xLoadingBuffer)，0.25%溴酚蓝，10xPCR缓冲液，琼脂糖，NaAc，TE缓冲液，酚氯仿，T4DNAligase及其缓冲液(10xligaseBuffer)试剂11绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20241.菌株培养12绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024将含有pEGFP质粒的DH5α菌株、含有pET-28a（+）质粒的DH5α菌株、空载的DH5α，分别用3~4mL含有Kan抗性的LB液体培养基37℃培养，摇床过夜。13绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024及分析技术2.质粒DNA的提取14绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024（1）分别取已经培养好的含有pEGFP质粒和含有pET-28a（+）质粒的大肠杆菌DH5α1.5mL置于Eppendorf管中，以12000r/min离心1min，去掉上清；重复一次。然后将小管倒扣在吸水纸上，尽量除培养基。加入150μL的GET缓冲液，室温下放置10min。(2)加入200μL的SDS溶液(含NaOH),缓慢轻柔地颠倒4-5次混匀后,冰上放置5min。(3)加入150uL预冷的KAc,缓慢轻柔地颠倒数次后冰上放置15min。(4)用台式离心机以12000/min离心5min,取上清液至一新的Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置5min,以12000/min离心5min,弃上清。15绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024(5)加入200μL的ddH2O溶解沉淀,加入100μL醋酸铵,混匀后冰置5min。(6)以12000r/min离心5min,取上清至一新的Eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置5min后,以12000r/min冷冻离心15min,弃上清。(7)沉淀用500μL的70%乙醇洗涤一次,以12000r/min离心5min,弃上清。除尽乙醇后,冷冻干燥5~10min。(8)加入20μL含有RNaseA的ddH20(或TE缓冲液)溶解提取物,充分溶解。16绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20243.DNA琼脂糖电泳鉴定质粒17绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024（1）制作胶板：琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g琼脂糖，置于耐高温高压试剂瓶中，加入30mLTBE（O.5×TBE）缓冲液，将该试剂瓶放入微波炉加热2-3次，每次1-2分钟，直至琼脂糖溶解，加热时要反复观察溶液中的琼脂糖颗粒是否完全溶解并且防止溶液溢出。取有机玻璃内槽，洗浄、晾干。取胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好。将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液充分摇匀，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。待凝固完全后大约30min，制备好胶板后应取下胶带，将铺有胶的玻璃内槽放在电泳槽中备用。将电泳槽内注满TBE稀释液，使TBE稀释液刚没过胶即可。轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的加样槽。（2）加样：预先染色DNA：分别在每个含有5μL样品的样品管内加入1μL6XLoadingBuffer，充分混匀，放置30分钟。在拿新的管加入10μLMarker和2μL的6XLoadingBuffer.。用移液枪进行点样。（3）电泳：连接电泳槽与电泳仪的正负极。通电，进行电泳。（4）拍照观察：将电泳结東后的凝胶放置成像仪上，用凝胶自动成像仪处理凝胶，拍摄照片，分析结果。18绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20244.DNA酶切19绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ切下EGFP片段,同时酶切pET-28a及pEGFP-N3载体。体系如表所示,37℃酶切3小时。20绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20245.DNA琼脂糖电泳和切胶回收所需酶切产物片段21绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024（1）DNA琼脂糖电泳:称取0.4g琼脂糖，加入40mLTBE（O.5×TBE）缓冲液,制作琼脂糖凝胶板，对酶切产物进行电泳分离;将25μL酶切产物加入加样孔中,使用120V电压对酶切产物进行电泳分离。电泳结束后观察结果,并且拍照;（2）酶切产物的回收：将质粒的酶切产物补水至200μL，加1/10体积（20μL）3MNaAc和2倍体积（400μL）冰冷的无水乙醇。置于-20℃冰箱，放置30min以上。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加0.5mL70%乙醇洗2次。弃上清，室温于燥，溶解至10μL无菌水中。（3）琼脂糖凝胶中回收目的DNA酶切产物片段（凝胺回收试剂盒）柱平衡:向吸附柱Ca2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。在长波紫外灯下，用干净的刀片将单一的DNA条带从凝胶上切下目的基因EGFP片段（尽量切除不含DNA的凝胶），放入干净的离心管中，称取重量。胶块中加入等体积的溶胶液PN，以0.1g凝胶对应100pL的体积加入溶胶液PN，在50℃水浴中放置10min，其间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解；将上一步得到的溶液加入到吸附柱Ca2中，（吸附柱放入收集管），室温静置2min，12000r/min离心30-60s，将收集管中废液弃掉，将吸附柱Ca2放入收集管中。向吸附柱Ca2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30-60s，将收集管中废液弃掉，将吸附柱Ca2放入收集管中。22绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024重复步骤上述步骤。将吸附柱Ca2放回收集管中，12000r/min离心2min，室温放置数分钟，彻底除去漂洗液PW。将吸附柱Ca2，置于室温10分钟，向吸附膜的中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液。23绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20246.连接反应24绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024（1）将酶切后的片段用T4-DNA连接酶相连（2）16℃连接过夜。25绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20247.宿主菌培养及感受态制备26绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024(1)加400μL过夜菌液至20mlBL液体培养基，放入37℃摇床中震荡培养2小时，当培养液开始出现混浊后，用分光光度计测600nm光吸值，A600nm<=0.7。(2)无菌条件下用灭菌的镊子取出一个灭菌的Eppendorf管，每管加菌液1.5mL，离心6000r/min离心2min,弃上清。(3)每管加入600uL冰冷的0.1mol/L的CaCl2，悬浮菌液,迅速冰上放置5min，离心6000r/min离心4min，弃去上清液。(5)每管加入300μL冰冷的0.1mol/LCaCl2液,小心悬浮细胞,迅速冰上放置,即制成了感受态细胞悬液感受态，分装3管，每管100μL,冰上放置以备使用。27绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20248.转化28绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024(1)将分装的两管进行标号，1号管为阴性对照，不含任何质粒，2号管为阳性对照，加入2μl的自提pET-28a，3号管为试验样品，加入4μl的连接产物,混匀后，冰上放置30min;(2)将冰浴好的1、2、3号管放入水浴锅中42℃保温90s，之后立即放入冰上冷却3-5分钟。(3)在超净台中加入100μlLB液体培养基,摇匀后37℃震荡培养15-30分钟。(4)倒平板：倒第一个平板标记为1号k-，后往培养基中加入60μl的Kna，继续倒第二个平板标记为1号k+，第三个平板标记为2号k+，第四个平板标记为3号k+。(5)涂板:各取1号管的菌液100μl涂布在1号k-和k+平板上，取2号管菌液100μl涂布在2号平板上,取3号管菌液100μl涂布在3号平板上。菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养12-16小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。29绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/20249.转板30绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024挑取转化产物生长的板上阳性菌落,转接到新的Kan抗性板上,37℃培养。31绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/202410.PCR筛选32绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024然后进行PCR筛选。每人取两个PCR专用管，按照下表体系添加试剂。PCR反应各步骤时间和温度分别为:94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃1min.30cycles,72℃7min。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。33绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/202411.阳性菌株培养34绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024等转板的菌长出以后,挑取2~3个阳性克隆摇菌,37℃过夜。35绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/202412.重组质粒提取36绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024(1)取已经培养好的含有pEGFP和pET-28a重组质粒1.5mL置于Eppendorf管中，以10000r/min离心1min，去掉上清；重复一次。然后将小管倒扣在吸水纸上，并用移液枪吸出多余的菌液，尽量除尽。加入150μL的GET缓冲液，充分混匀，室温下放置10min。使用EDTA是为了除去细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易与细胞壁接触。(2)加入200μL新配置的0.2mol/LNaO(内含1％SDS),缓慢轻柔地颠倒2-3次混匀后,冰上放置5min。SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。(3)加入150uL预冷的KAc,缓慢轻柔地颠倒数次后冰上放置15min。(4)用台式离心机以12000/min离心5min,取上清液至一新的Eppendorf管中。(5)加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置5min,以12000/min离心5min,弃上清。(6)加入200μL的ddH2O溶解沉淀,加入100μL醋酸铵,混匀后冰置3-5min。以12000r/min离心5min,取上清。(7)转以上清至一新的Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇,-20℃冷冻30min后，以12000r/min冷冻离心10min,弃上清。(8)沉淀用500μL的70%乙醇洗涤一次,以12000r/min离心5min,弃上清。除尽乙醇后,打开盖子自然干燥。(9)加入30μL的ddH20溶解提取物,充分溶解，室温放置10min以上，放入4℃冰箱待用。37绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/202413.重组质粒酶切鉴定38绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024用BamHⅠ和NotⅠ同时对提取的质粒进行酶切,每个反应体系如下琼脂糖电泳,对酶切产物条带进行分析,确定正确连入外源ECFP片段的pET-28a融合质粒。39绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/202414.BI21(DE3)培养及感受态细胞制备40绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024(1)加400μL过夜菌液至20mlBL液体培养基，放入37℃摇床中震荡培养2小时，当培养液开始出现混浊后，用分光光度计测600nm光吸值，A600nm<=0.7。(2)无菌条件下用灭菌的镊子取出一个灭菌的Eppendorf管，每管加菌液1.5mL，离心6000r/min离心2min,弃上清。(3)每管加入600uL冰冷的0.1mol/L的CaCl2，悬浮菌液,迅速冰上放置5min，离心6000r/min离心4min，弃去上清液。(5)每管加入200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2液,小心悬浮细胞,迅速冰上放置,即制成了感受态细胞悬液感受态，分装两管，每管100μL,冰上放置以备使用。41绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/202415.转化入表达载体42绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告5/9/2024(1)将分装的两管进行标号，一管为1号管，另一管为2号。1号管中不加任何质粒，2号管终加入3μl的连接产物在感受态细胞悬液中,混匀后，冰上放置30min;(2)将冰浴好的1、2号管放入水浴锅中42℃保温90s，之后立即放入冰上冷却3-5分钟。(3)在超净台中加入100μlLB液体培养基,摇匀后37℃震荡培养15-30分钟。(4)倒平板：倒第一个平板标记为1号k-，后往培养基中加入45μl的Kna，继续倒第二个平板标记为1号k+，第三个平板标记为2号k+，第四个平板标记为2号k+，待平板冷却后将IPTG均匀徒步在2号k+平板上。(5)涂板:各取1号管的菌液100μl涂布在1号平板上，各取2号管菌液100μl涂布在2号平板上,涂布完成后37℃倒置培养(6)第二天在荧光激发下可看到平板上长出绿色菌落,照相保存结果。此时完全证明绿色荧光蛋白已得到表达。43绿色