DNA和RNA提取原理和方法

核酸提取及常见问题分析主讲人：刘召华唐维〔修改〕第一局部：DNA提取方法简介第二局部：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三局部：RNA提取方法简介第四局部：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最根本的操作。前言第一局部：DNA提取方法简介第二局部：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三局部：RNA提取方法简介第四局部：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第一局部：DNA提取方法简介DNA提取的几种方法基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法其它DNA提取的几种方法

非基因组DNA的提取

质粒DNA的提取

碱裂解法煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取

差速离心结合SDS裂解法基因组DNA－CTAB法CTAB法原理〔植物DNA提取经典方法〕CTAB〔hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵〕，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中〔>0.7mol/LNaCl〕是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参加乙醇沉淀即可使核酸别离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其参加冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

CTAB提取缓冲液的经典配方

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl〔pH8.0〕提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP〔脱氧核糖核蛋白〕。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于别离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，防止褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法褐变CTAB提取缓冲液的改进配方

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP〔聚乙烯吡咯烷酮〕是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法PVP〔聚乙烯吡咯烷酮〕PVP按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。

在研磨过程中参加PVP，其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的时机。同时向抽提液中参加复原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。

CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解枯燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－CTAB法

SDS法原理基因组DNA－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温〔55～65℃〕条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度〔冰浴〕，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取缓冲液2.65水浴60min,其间缓慢摇动几次。3.参加150ul的5mol/LKac,混匀,冰浴15min左右SDS法流程图〔以动物组织为例〕动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法基因组DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法

根据细胞裂解方式的不同有：基因组DNA－其它方法吸附材料结合法：根据核酸别离纯化方式的不同有：硅质材料

阴离子交换树脂磁珠

高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达别离目的。基因组DNA－其它方法浓盐法：

有机溶剂抽提法：

密度梯度离心法：

利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者别离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理别离各种内容物质粒DNA－碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子那么以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA－碱裂解法碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀枯燥溶解沉淀质粒DNA溶液SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分及作用溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以参加RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。溶液III3M醋酸钾/2M醋酸这一步的K置换了SDS〔十二烷基磺酸钠〕中的Na，得到PDS〔十二烷基磺酸钾〕沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大局部蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀质粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子那么以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。细胞器DNA－差速离心法差速离心法原理是利用物质比重的不同别离混合物的一种方法。将待别离物质置于均匀介质〔蔗糖〕中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以别离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级别离出来。第一局部：DNA提取方法简介第二局部：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三局部：RNA提取方法简介第四局部：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第二局部：DNA提取常见问题、原因分析及其对策DNA提取的根本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸别离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞〔白细胞〕组培细胞培养时间不能过长，否那么会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体〔老化菌体导致开环质粒增加〕培养时应参加筛选压力，否那么菌体易污染，质粒易丧失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，那么应加大菌体用量菌株不要频繁转接〔质粒丧失〕严谨性质粒和松弛性质粒按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内那么属松弛型。细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长〔5分钟〕，否那么质粒易被打断复性时间也不宜过长，否那么会有基因组DNA的污染G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁核酸别离、纯化采用吸附材料吸附的方式别离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机〔酚/氯仿〕抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心别离两相时，应保证一定的转速和时间〔猕猴桃大提，10000转20min〕针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取核酸别离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性〔SDS、异硫氰酸胍等〕高盐洗涤蛋白酶处理多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参加1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中参加200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸别离、纯化多酚的去除：在抽提液中参加防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等参加易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合核酸别离、纯化盐离子的去除：70％的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时参加1/10体积的NaAc〔pH5.2，3M〕，有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发〔不要过分枯燥〕假设长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解基因组DNA的提取质粒DNA的提取DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反响DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质〔具体方法见前〕重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数〔2-3次〕DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反响。

原因对策材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料防止反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前参加裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，防止反复冻融DNA提取常见问题问题二：DNA降解。对策

原因实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丧失尽量选用新鲜〔幼嫩〕的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长〔对于动物细胞、细菌可增加PK的用量〕低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少。对策

原因猕猴桃DNA提取实例1.CTAB配方如上,配制好备用,65度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,防止酚类物质氧化2.65°水浴一个小时3.氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液两次。10000转/别离心20分钟，尽量把丝状物压紧，防止吸取上清时有丝状物牵拉等体积预冷的异丙醇，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次。用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后参加3-5mlTE溶解，参加5ul,1mg/ml的RNA酶后保存猕猴桃基因组DNA第一局部：DNA提取方法简介第二局部：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三局部：RNA提取方法简介第四局部：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第三局部：RNA提取方法简介RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以别离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯洁RNA。RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍〔亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等〕。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化别离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠〔pH4.0〕：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法影响RNA提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如假设材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要屡次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存影响RNA提取的因素影响RNA提取的因素

样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量影响RNA提取的因素纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反响的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素第一局部：DNA提取方法简介第二局部：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三局部：RNA提取方法简介第四局部：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第四局部：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策RNA提取常见问题RNA的降解

OD260/OD280

比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量缺乏组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难防止RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前防止融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280

比值偏低蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，参加氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，参加氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280

比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决方法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。电泳带型异常

非变性电泳：上样量超过

3ug，电压超过

6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致

28S和

18S条带分不开。

变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。下游实验效果不佳

RNA降解

抽提试剂