HYT 0319-2021 贝类 脂溶性海洋生物毒素的检测 液相色谱-串联质谱法

中华人民共和国海洋行业标准贝类脂溶性海洋生物毒素的检测液相色谱-串联质谱法Shellfish—Determination中华人民共和国自然资源部发布HY/T0319—2021 I 2规范性引用文件 3原理 4试剂和材料 5仪器设备 2 37试验步骤 38结果计算与表述 59精密度 6 6附录A(资料性)脂溶性海洋生物毒素 7附录B(资料性)特征离子质量色谱图 8附录C(规范性)脂溶性海洋生物毒素的毒性因子 参考文献 I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中华人民共和国自然资源部提出。本文件由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本文件起草单位：国家海洋环境监测中心、中国科学院海洋研究所、厦门大学、中国水产科学研究院黄海研究所。1贝类脂溶性海洋生物毒素的检测液相色谱-串联质谱法警示——为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液管及移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在次氯酸钠溶液(5%)浸泡1h以上以使毒素分解。酸毒素、环亚胺毒素等11个毒素化合物的液相色谱-串联质谱检测方法原理、操作步骤及结果计算等。本文件适用于贝类体中脂溶性海洋生物毒素的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理贝类样品经甲醇提取，碱性条件下水解释放酯化态生物毒素部分，用HLB固相萃取柱净化，液相4试剂和材料4.2甲醇(CH₃OH):色谱纯。4.5氨水(NH₃·H₂O):浓度≥25%。4.6氢氧化钠(NaOH)。4.7盐酸(HCL):浓度≥36%。4.8氢氧化钠溶液(2.5mol/L):准确称取50g氢氧化钠，用水定容至500mL,室温保存。4.9盐酸溶液(2.5mol/L):准确量取104.5mL盐酸，用水定容至500mL,室温保存。4.10甲醇溶液(30%):量取30mL甲醇加到70mL水中，混合均匀，室温，现用现配。4.11甲醇溶液(20%):量取20mL甲醇加到80mL水中，混合均匀，室温，现用现配。4.12氨水甲醇溶液(0.3%):吸取0.3mL氨水，用甲醇定容至100mL,室温，现用现配。AZA2、AZA3、GYM、SPX1标准物质纯度≥97%,避光保存于一20℃。24.14脂溶性海洋生物毒素标准储备液：分别吸取适量的各脂溶性海洋生物毒素标准溶液(见4.13),甲醇(见4.2)配制储备溶液。0.22μm滤膜(见5.12)过滤，一20℃避光保存备用。各脂溶性海洋生物毒素标准储备液浓度分别为：OA40ng/mL,DTX140ng/mL,DTX240ng/mL,YTX400ng/mmoYTX400ng/mL,PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mL,GYM10ng/mL,AZA1200ng/mL,AZA2100ng/mL,AZA3100ng/mL。4.15脂溶性海洋生物毒素混合标准工作溶液：分别吸取适量的各脂溶海洋生物毒素标准储备溶液(见混合标准工作溶液(OA、DTX1、DTX2、YTX、homoYTX)。0.22μm滤膜(见5.12)过滤，-20℃避光保存备用。各脂溶性海洋生物毒素的浓度见表1。表1脂溶性海洋生物毒素标准工作溶液组别浓度15负离子5555仪器设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。5.2分析天平：感量0.00001g。5.5涡漩振荡器。5.6离心机。5.7水浴锅。5.8固相萃取装置。5.9真空泵。5.11固相萃取柱：基质为含有N-乙烯吡咯烷酮聚合物的吸附剂，填料质量为30mg,体积为1mL,或者相当。36样品用清水将贝类外表清洗干净。切开闭壳肌打开贝壳，用蒸馏水淋洗贝类内部以清除泥沙和其他杂物，取出贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上沥水5min。为保证样品的均匀性，至少取100g贝肉用匀质机匀浆30min,充分混匀。7试验步骤称取2.00g贝类组织匀浆于具塞离心管中。加入9.0mL甲醇(见4.2),用涡旋振荡器混匀1min,3000rpm离心10min,上清液转移至20mL的容量瓶中，沉渣再加入9mL甲醇(见4.2)重复提取一次，合并两次提取液，用甲醇(见4.2)定容至20mL,将溶液分成两份，备用。为了检测酯化态的OA组毒素含量。取1.0mL(7.1中的一份)放入色谱进样瓶中，加入125μL氢氧化钠溶液(见4.7),用涡旋振荡器混匀0.5min,置于76℃水浴40min,冷却至室温，加入125μL盐酸溶液(见4.8)中和，涡旋混匀0.5min,0.22μm滤膜过滤后备用。固相萃取柱依次用1.0mL甲醇活化、1.0mL30%甲醇平衡。取1.0mL提取液(7.1中的另一份)加2.8mL水混匀后转入预处理的固相萃取柱，以约每秒一滴的流速通过固相萃取柱，用1.0mL20%甲醇溶液淋洗，再以1.0mL氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，摇匀后，0.22μm滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。按照7.3步骤净化水解液(见7.2)。7.4样品测定7.4.1正离子模式液相色谱参考条件正离子模式测定PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1,液相色谱参考条件如下。b)流动相：A:2mmol/L甲酸铵和50mmol/L甲酸的水溶液；B:2mmol/L甲酸铵和50mmol/L甲酸的95%乙腈水溶液。d)柱温：25℃。f)流动相梯度：0min～4min,10%B线性变化至80%B;4min～6min,保持80%B,6min~6.5min线性变化至10%B,平衡2.5min。7.4.2负离子模式液相色谱参考条件负离子模式测定OA、DTX1、DTX2和YTX、homoYTX,液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：C18,150mm×3.0mm,填料粒径3.5μm,或相当者。b)流动相：A:0.05%的氨水溶液(pH11);B:含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10,体积比)溶液4f)流动相梯度：1min～10min,10%B线性变化至90%B;10min～13min,保持90%B,13min~15min线性变化至10%B,平衡4min。7.4.3质谱条件质谱条件如下：a)离子源：电喷雾离子源。b)扫描模式：正离子和负离子模式。c)检测方式：多反应监测。d)喷雾电压：4500V。e)毛细管温度：450℃(正离子模式);600℃(负离子模式)。f)源内碰撞解离电压：5V。g)雾化气流速：60L/min。h)辅助加热气流速：50L/min。i)离子碎片参数见表2。表2离子对、锥孔电压和碰撞电压目标毒素子离子m/zVV5HY/T0319—2021合表3要求。各毒素的特征离子质量色谱图见附录B。表3定性测定相对离子丰度的最大允许偏差允许的相对偏差 (1)c;从标准工作曲线中得到的试样中脂溶性海洋生物毒素溶液浓度，单位为纳克每毫升c。——从标准工作曲线中得到的空白试验中脂溶性海洋生物毒素溶液浓度，单位为纳克每毫升脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附录C。样品中脂溶性海洋生物毒素的含量则按照毒性因69精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。本方法的批内相对标准偏差≤15%,实验室间相对标准偏差≤37%。本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg～200μg/kg添加浓度水平上的回收率为80%～120%。表4脂溶性海洋生物毒素定量限目标毒素定量限7脂溶性海洋生物毒素标准名称及相关信息见表A中文名称鳍藻毒素-1原多甲藻酸-1原多甲藻酸-2原多甲藻酸-313-去甲螺旋内酯C8(资料性)特征离子质量色谱图负离子和正离子模式下脂溶性海洋生物毒素特征离子色谱图如图B.1和图B.2所示。图B.1负离子模式下脂溶性海洋生物毒素混合标准品溶液特征离子质量色谱图9离子强度/eps离子强度/eps离子强度/cps图B.2正离子模式下脂溶性海洋生物毒素混合标准品溶液特征离子质量色谱图目标毒素毒性因子(r)1pgOA当量/kg11pgPTX当量/kg1pgAZA当量/kg11[1]GB5009.212食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定[2]海洋生物毒素欧盟参考实验室标准