盐酸尼卡地平氯化钠注射液细菌内毒素检查法的研究

摘

要：目的：对盐酸尼卡地平氯化钠注射液细菌内毒素检查法进行研究。方法：采用鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验和对比试验，与家兔热原检查法的结果进行比较。结果：盐酸尼卡地平氯化钠注射液用稀释剂稀释4倍后，可使用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂进行细菌内毒素检查，与家兔热原检查法结果一致。结论：盐酸尼卡地平氯化钠注射液（规格100mL/瓶：盐酸尼卡地平10mg、氯化钠0.9g）用细菌内毒素检查法替代热原检查法是可行的。关键词：盐酸尼卡地平氯化钠注射液；细菌内毒素；检查法；干扰试验；复核试验

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引言盐酸尼卡地平氯化钠注射液为血管扩张药物，临床上主要用于不宜或无法口服治疗的高血压病人的短期治疗。该药品为钙通道阻滞剂，可抑制心肌与血管平滑肌的跨膜钙离子内流而不改变血钙浓度。该药品还具有高度的血管选择性，对血管平滑肌的钙离子拮抗作用强于对心肌的拮抗作用。在动物实验中，该药品可扩张冠状血管平滑肌。盐酸尼卡地平氯化钠注射液。该品种的质量标准检测项目有：pH值、颜色、有关物质、重金属、热原、不溶性微粒、装量、可见异物、无菌等。其中，热原项目的检查使用实验动物家兔做实验，系将一定剂量的供试品溶液静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。该检查方法所用家兔的饲养时间长，操作繁琐，实验结果受家兔的个体差异影响较大。而细菌内毒素检查法具有简便、灵敏、快速、准确等特点，已被广泛用于药品注射剂及其原料药和临床医疗器械中的致热物质检查。本研究旨在对盐酸尼卡地平氯化钠注射液的细菌内毒素检查法进行试验，并将试验结果与热原检查法的结果进行对比。细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶限度法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。按2015版《中国药典》四部的要求，在供试品检测时，可使用上述其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。为探讨采用细菌内毒素检查法检测盐酸尼卡地平氯化钠注射液热原的可行性，笔者按实验方案进行了鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验和对比试验。

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仪器与材料1.1

仪器XW-80A旋涡混合器，上海医科大学仪器厂；TAL-40型恒温试管仪，湛江安度斯生物有限公司。1.2

材料鲎试剂（批号16051012、16050712，标示灵敏度0.125EU/mL）；细菌内毒素工作标准品（批号160924，规格10EU/支）；细菌内毒素检查用水（批号17031202，规格2mL/支）；盐酸尼卡地平氯化钠注射液（规格100mL/瓶）：盐酸尼卡地平10mg、氯化钠0.9g；家兔（新西兰兔）。

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方法与结果2.1

鲎试剂灵敏度复核试验按照2015版《中国药典》四部细菌内毒素检查法要求，将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混合15min，然后制备成0.25EU/mL、0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL的内毒素标准溶液，每稀释一次均应在旋涡混合器上混匀30s，再进行灵敏度复核试验，结果如表1所示。表1结果表明，本研究所用鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/mL，测得灵敏度λc为0.125EU/mL，λc/λ＝1。按照药典规定，当λc为0.5～2.0λ（包括0.5λ或2.0λ）时，可以用于细菌内毒素检查。

2.2

供试品内毒素理论限值的确定盐酸尼卡地平氯化钠注射液的内毒素理论限值计算公式：L≤K/M式中

L——盐酸尼卡地平氯化钠注射液的内毒素理论限值，EU/mL；K——人用每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量，EU/kg·h，一般注射剂K＝5EU/kg·h；M——人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，mL/kg·h，人均体重按60kg计算。盐酸尼卡地平氯化钠注射液的最大用量为75mL/h，计算得本品内毒素理论限值为4.0EU/mL。通常大容量注射剂（≥100mL）质量标准中的内毒素限值为0.5EU/mL，本着标准从严要求，且参考2015版《中国药典》二部类似品种盐酸尼卡地平葡萄糖注射液（规格100mL/瓶：盐酸尼卡地平10mg、葡萄糖5.5g）质量标准项，细菌内毒素检查法：取本品，依法检查（通则1143），每1mL中含内毒素的量应小于0.5EU。因此，本次研究目标确定盐酸尼卡地平氯化钠注射液的内毒素理论限值为0.5EU/mL。2.3

干扰试验盐酸尼卡地平氯化钠注射液的最大有效稀释倍数计算公式：MVD＝CL／λ式中

L——供试品的细菌内毒素限值；C——供试品溶液的浓度；λ——在凝胶限度法中鲎试剂的标示灵敏度，EU/mL。当L以EU/mL为单位时，则C等于1.0mol/mL；当L以EU/mg或EU/U为单位时，C的单位为mg/mL或U/mL。通过上述公式，可以计算出盐酸尼卡地平氯化钠注射液的最大有效稀释倍数为4倍。取热原符合规定的盐酸尼卡地平氯化钠注射液3批（批号：2016070761、2016070762、2016070861），用细菌内毒素检查用水稀释4倍后，将用来溶解细菌内毒素的工作标准品与用水配制的相应浓度的内毒素溶液，同时与2个批号的鲎试剂进行干扰试验，结果如表2、表3所示。表2、表3结果表明，B系列溶液的结果呈阴性，表明盐酸尼卡地平氯化钠注射液用水稀释4倍后对细菌内毒素检查有干扰。在查阅相关资料的基础上，笔者改用硼砂-氯化钙缓冲液（pH=8.0）对盐酸尼卡地平氯化钠注射液进行4倍稀释，干扰试验的结果如表4、表5所示。表4、表5结果表明，溶液A和阴性对照D的所有平行管均为阴性，且C系列的结果与鲎试剂灵敏度的复核结果一致，说明试验结果有效。B系列溶液的结果与鲎试剂灵敏度的复核结果一致，表明更换稀释剂稀释4倍后，盐酸尼卡地平氯化钠注射液对细菌内毒素检查法无干扰作用。2.4

细菌内毒素检查法与家兔热原法对比试验根据上述干扰试验结果和盐酸尼卡地平氯化钠注射液的内毒素限值，笔者对10个批次的盐酸尼卡地平氯化钠注射液进行了细菌内毒素检查法和家兔热原法的对比试验，结果如表6所示。将盐酸尼卡地平氯化钠注射液用硼砂-氯化钙缓冲液（pH=8.0）稀释4倍后，采用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂进行检测，标准限度按“每1mL盐酸尼卡地平氯化钠注射液中含内毒素的量应小于0.50EU”判定，结果显示细菌内毒素检查全部为阴性，家兔热原法检查也全部合格，两种检查方法结果一致。3

结语本研究证实，鲎试剂灵敏度试验表明，试验所用鲎试剂符合规定要求。干扰试验表明，用水稀释盐酸尼卡地平氯化钠注射液4倍，对细菌内毒素检查法有干扰，更换稀释剂后，将盐酸尼卡地平氯化钠注射液用硼砂-氯化钙缓冲液（pH=8.0）稀释至4倍时，采用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂进行检测，标准限度按“每1mL盐酸尼卡地平氯化钠注射液中含内毒素的量应小于0.50EU”判定，细菌内毒素检查结果全部为阴性，家兔热原