超高压技术在天然产物提取中的应用

摘

要：超高压技术是近年来发展较快的一种新型提取技术，具有快速、高效、能耗少、提取温度低、操作简单以及绿色环保等特点。现简单阐述了超高压技术的基本原理和主要特点，综述了国内外近年来采用超高压技术提取天然活性成分方面的研究进展，同时对超高压技术在天然产物提取方面的应用进行了展望。关键词：超高压技术；天然活性成分；提取；原理

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引言天然产物的品种繁多，所含成分十分复杂，且其有效成分多为细胞内物质，因此其有效成分提取的本质是让目标成分从细胞内释放，经多孔细胞膜壁扩散到溶剂中的过程。目前，所有提取方法的目的都是强化目标成分从基质向提取溶剂扩散，同时保持目标成分的活性。为了提高天然产物的治疗效果，降低不良反应，选择合理的提取工艺尤为重要。天然产物常用的提取方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取法、索氏提取法等，这些方法普遍存在能耗高、溶剂消耗大、周期长、工序多、提取率不高等缺点，制约了天然产物的进一步研发。为了克服这些不足，亟需寻求一种新的高效、快速、方便、自动化的提取方法。超高压技术（ultra-highpressureextractiontechnology，UHPE）的出现顺应了这一发展趋势。超高压技术的应用领域非常广泛，为生物医药和食品工程的科学研究、产品开发、工艺革新提供了新的平台。超高压技术是近年来发展较快的一种新型提取技术，具有快速、高效、能耗少、提取温度低、操作简单以及绿色环保等特点[2]。该技术最初应用于食品保鲜、食品品质改良、食品安全控制、食品乳化和成型等方面，并由此推动了相关生物技术的应用基础研究。随着应用范围的逐渐增大以及技术发展的日趋成熟，超高压技术开始应用于天然产物的提取领域。

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超高压技术的发展超高压技术最初被广泛应用于陶瓷、金属、石墨等材料加工领域，直至20世纪80年代后期才逐渐作为一种新型的灭菌方法和加工技术应用于食品工业领域。

1899年，美国化学家通过对牛奶的高压研究发现，在650MPa作用下可以减少牛奶中微生物的数量。1914年，美国物理学家提出了在静水压下蛋白质变性、凝固的报告。随后，又发现，经过高压处理的水果保存期至少可以达到5年。1986年，日本京都大学率先开展了高压食品的研究，提出了高压在食品加工中应用的研究报告后，1991年第一种高压食品——果酱，正式在日本问世，标志着高压食品加工技术取得了突破性进展。随着超高压技术研究的深入发展，超高压生物加工技术已经成为21世纪的尖端科技之一，它涉及微生物学、生物物理、生物化学、医学医药、营养学、食品工程、材料学等诸多领域。目前，日本、美国、韩国、法国等国家先后对高压食品的加工原理、方法、技术细节以及应用前景等进行了广泛深入的研究，并已逐步进入市场。我国学者也一直密切关注着国际上超高压技术的发展趋势，并尝试利用这一新兴技术进行天然产物的提取。2

超高压技术原理超高压（UHP）的全称是“超高冷等静压”。根据目前科学技术的发展状况和液压技术的特点，将超高压定义为100MPa以上的压力。超高压技术的基本原理是在常温条件下，对原料液施加100～1000MPa的流体静压力，保压一定时间后迅速卸除压力，进而完成整个提取过程。溶剂在超高压作用下可渗透到固体原料内部，使原料中的有效成分溶解在提取溶剂中，在预定压力下保持一定的时间，使有效成分达到溶解平衡后迅速卸压，在细胞内外渗透压的作用下，有效成分可迅速扩散到组织周围的提取液中。另外，在超高压的作用下，还可以观察到提取后药材细胞壁、细胞膜以及细胞内液泡等结构的变化，促进细胞内可溶物质和提取溶剂的充分接触。2.1

超高压提取中药有效成分一般天然产物的提取可分为三个过程：一是药材浸润和润湿过程；二是溶质的解吸和溶解过程；三是溶质的扩散和置换过程。药材浸润和溶质溶解、置换过程就是溶剂通过药材颗粒表面进入细胞内，使细胞内部充满溶剂，从而使其中的可溶物质逐步溶解于溶剂中，形成溶液。药材颗粒表面有宏观毛细孔（一般半径≥10-5

cm）和微观毛细孔（一般半径＜10-5cm）。药材浸润过程中，溶剂首先充满宏观毛细孔和微观毛细孔，同时通过细胞壁渗透扩散。药材浸润和溶质溶解、置换过程的速度，与溶剂性质、固体药材内毛细孔状况、细胞壁的结构、性质以及药材的表面状态、比表面积、提取温度、压力等因素有关，一般来说温度越高，压力越大，浸润速度越快。2.2

超高压技术的影响因素超高压技术作为天然产物的提取方法在2004年首次被提出，并对其进行了适用性研究，发现该技术可以缩短提取时间，提高得率和产品纯度。超高压技术的主要影响因素有：提取液种类、料液比、温度、保压时间和压力大小。超高压提取过程的压力对提取效率的影响可以从以下不同阶段加以说明。（1）升压阶段：压力在几分钟内（一般小于5min）迅速由常压升至几百兆帕，固体组织细胞内外形成了超高的压力差，提取溶剂在超高压力推动下迅速渗透到植物内部的维管束和腺细胞内。随着压力迅速升高，细胞体积被压缩，如果超过其形变极限，就会导致细胞破裂，细胞内的物质与溶剂接触被溶解；如果没有超过细胞的形变极限，提取溶剂就会在高压作用下，进入植物细胞内，使有效成分溶解在提取溶剂中。（2）保压阶段：超高压力引起体系的体积变化，推动化学平衡的移动，溶剂的渗透与溶质的溶解快速达到平衡。因此保压阶段时间很短，一般几分钟之内即可完成。（3）卸压阶段：卸压一般在几秒钟之内即可完成（一般卸压时间＜2s），组织细胞的压力从几百兆帕的超高压迅速减小为常压，在反方向压力作用下，发生流体以及药物基质体积的爆破膨胀，对细胞壁、细胞膜、质膜、核膜液泡微管等形成强烈的冲击使其发生变形。如果变形超过其变形极限，导致细胞结构出现松散、孔洞、破裂等结构变化，有效成分和溶剂充分接触，溶解了有效成分的溶剂就会向细胞外迅速扩散；如果在反方向压力作用下细胞壁的变形没有超过其变形极限（在高压作用下通透性增大），细胞内部已经溶解了有效成分的溶剂在高渗透压差下快速转移到细胞外，达到提取的目的。在流体吸收外界施加的压缩能一定（压力一定）的情况下，卸压时间越短，细胞内流体在向外扩散的同时产生的冲击力越强，引起的湍动效应越强烈，形成的孔洞、碎片越多，一定质量的药物基质的有效比表面会越大，有效成分扩散的传质阻力就会越小，与溶剂接触也就会更充分，提取效率会更高。3

超高压技术的特点超高压能够对非共价键（氢键、离子键、疏水键）产生影响，而共价键影响并不敏感，故生物大分子成分可发生变性，而对小分子物质（如皂苷、黄酮、生物碱、挥发油、单糖、维生素、色素等）的分子结构没有影响。因此，高压具有可使蛋白质变性、酶失活、微生物死亡，而不破坏药物中的小分子有效成分的生理活性，可以达到提取、灭菌的目的。超高压技术与其他传统的提取技术相比，具有许多独特的优势，具体表现在以下方面：3.1

提取时间短超高压提取的升压和保压阶段中，超高的压力差使提取溶剂迅速渗透到固体药物组织内部，有效成分快速溶解在提取溶剂中；卸压阶段中，超高的反向压力差为溶解在提取溶剂中的有效成分，由固体组织内部向外的扩散提供了超高的传质动力，有效成分能够快速扩散到固体组织外，因此超高压技术能显著地缩短提取时间。3.2

溶剂消耗少超高压提取是在一个完全封闭的条件下进行的，没有溶剂的挥发消耗，而且目标成分由固体组织向周围溶剂的扩散，不是单纯靠浓度梯度提供传质动力，而是主要靠压力差提供。因此，超高压技术选择的固体原料与提取溶剂的比例较其他方法都要少，能明显地降低溶剂的消耗。3.3

提取效率高、得率高超高压提取的压力最高可达700MPa。在这样高的压力下，可以显著地提高提取效率，并且在超高压下，组织结构发生变化，与溶剂的接触面积增大，传质阻力降低，有效成分溶解迅速、充分，因而提取得率高。3.4

提取温度低在绝热条件下，压力每提高100MPa，水的温度升高3℃左右。实际提取时，由于高压容器壁与周围环境有热交换，温度升高的程度远小于上述数值。因此，高压提取可以维持在接近常温的条件下进行。这对于天然产物中的热敏性成分以及易挥发性成分的提取是极为有利的。同时，由于超高压提取使用的是流体静压力，压力传递是在瞬间完成的，容器内任何方向和位置的压力相等，因此超高压提取对物料的作用是均匀一致的。这就避免了像微波提取、热回流提取过程中因局部受热不均，造成目标成分的结构变化和损失，从而保证了有效成分具有更高的生物活性。3.5

提取液稳定性好超高压提取可以在接近室温的条件下进行，不会因热效应造成小分子物质的结构变化，导致其生理活性的降低。同时，高压提取会使生物大分子立体结构中的氢键结合疏水键、离子键等非共价键发生变化，使蛋白质变性、酶失活、细胞膜破裂等。因此，提取液的稳定性较常规的提取方法明显提高，提取液中杂质成分的溶出较常规的回流提取明显降低，使提取产物的品质提高，也易于提取液的保存和后续的分离纯化。3.6

节能与传统的热提取相比，在超高压提取过程中，液体体积变小，且没有溶剂因相变而造成能量消耗。同时，由于提取过程温度变化不大，体系与外部环境的热量交换也很少。因此，只是在升压阶段提取溶剂的体积压缩过程要消耗部分能量，但由于液体体积压缩量不大，因而消耗的能量不大，整个提取过程能量损耗很低。3.7

设备安全性高、操作简单超高压提取的液体媒介在高压下的压缩比较小，因而即便发生泄漏，也不会带来像气体那样灾难性的危害。对于直接式提取设备，料液的加入和导出，压力的升降都可以借助机械设备自动完成，机械化程度高，适宜于现代化大生产。3.8

应用范围广超高压提取应用的提取溶剂，可以根据有效成分的溶解性自由选择，因此应用的范围更加广泛。3.9

绿色环保超高压提取是在一个完全封闭的环境下进行，没有溶剂的挥发，因此不会因溶剂的挥发造成对环境的污染，符合降低能源消耗、保护生态环境的要求。

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超高压技术在天然产物提取分离中的应用4.1

多糖类化合物提取多糖是一类重要的具备生物活性的天然产物，由多个相同或者不相同的单糖通过糖苷键连接而成，常以结合的形式存在于植物、动物、真菌等体内，如核蛋白、蛋白多糖、脂多糖等。多糖具有复杂、多方面的生物活性和功能，大量药理及临床研究证实，多糖具有抗感染、促进免疫、防治肿瘤、抗疲劳、抗凝血、抗动脉粥样硬化、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒、抗氧化等药理作用。此外，它还具有治疗病理性肝炎、类风湿、艾滋病等免疫损伤或免疫缺陷症，而且对机体几乎无毒副作用。多糖对维持生命活动有着很重要的作用，因此具有广阔的应用前景。通过正交实验法，以多糖得率为指标，考察了料液比、温度、压力、保压时间等因素对多糖提取的影响，得到了超高压提取灵芝孢子粉多糖的最佳工艺条件。然后，将其与水浸提法比较，结果发现，超高压提取具有得率高、提取温度低、提取时间短、节能等优点，为灵芝多糖的提取提供了一种新技术。采用均匀设计的方法研究得到超高压提取黄芪多糖的最佳工艺，并与热水回流和超声波辅助提取两种方法相比较，研究发现，这三种方法均采用水为提取溶剂，相比较而言，超高压提取节能、省时且得率高，优于另外两种提取方法。利用超高压技术从蛹虫草中提取多糖，采用响应面法优化得到最佳提取工艺条件。通过铁离子还原法和自由基清除法（超氧自由基、羟基自由基和DPPH自由基）评价超高压提取后多糖的抗氧化活性，发现采取超高压技术提取的多糖具有显著的抗氧化活性，可以作为一种新型抗氧化剂。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计和响应面分析方法，确定超高压提取的最佳工艺，并从清除ABTS自由基和DPPH自由基能力方面评价火龙果茎多糖的体外抗氧化能力。结果表明，火龙果茎多糖的超高压提取的最佳工艺条件为：液固比10:1、超高压压力300MPa、超高压时间4min。在此工艺条件下多糖得率为2.83%±0.02%。除此之外，还有非常多的研究也运用超高压技术从植物中提取多糖类化合物，相关参数如表1所示。超高压技术在提取多糖类化合物方面得到了较广泛的应用，展现出其节能、高效的特点，说明超高压技术是提取植物多糖的一种有效方法。大量实验研究证明，超高压会使大分子物质变性，因此超高压不适用于提取分子质量较大的多糖物质，否则会影响提取物的生物活性。在常温高压提取黄芪多糖的研究中发现，大分子多糖中含有较多的非共价键，超高压技术在提取过程中会间接破坏多糖的活性。在超高压提取香菇多糖的研究中也指明，分子质量高的多糖的二级结构中富含氢键，而超高压能破坏其中的氢键。虽然超高压技术能够提高多糖分子结构的灵活性和可溶性，但在一定程度上也影响了多糖的活性。因此，使用超高压技术提取时，保证大分子活性物质的稳定性是关键。尽管如此，超高压技术对提取物质的影响依然小于其他提取方式。表1

超高压提取多糖类化合物4.2

皂苷类化合物提取皂苷（Saponin）是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，主要分布于陆地高等植物中，少量存在于海星和海参等海洋生物中。皂苷类化合物作为二级代谢产物广泛分布于植物中，是植物防御系统的屏障，以对抗病原体和食草动物。皂苷类化合物按皂苷配基的结构可以分为三萜皂苷和甾体皂苷两大类，例如人参皂苷、柴胡皂苷等属三萜皂苷，麦冬皂苷、薯蓣皂苷等为甾体皂苷。皂苷的化学结构中，由于苷元具有不同程度的亲脂性，糖链具有较强的亲水性，使皂苷成为一种表面活性剂，经水溶液振摇后能产生持久性的肥皂样泡沫。同时，越来越多的研究证明皂苷类化合物具有广泛的药理作用：（1）调节血压、血脂，对血压血脂具有双向调节作用；（2）降血糖，对糖尿病有辅助治疗作用，能降低尿糖、血糖含量；（3）抗衰老、提高记忆力，能增强人体代谢功能，加速细胞修复；（4）抗肿瘤，能增强肿瘤患者的DNA代谢，促进免疫球蛋白的产生，增进食欲，缩短化/放疗的周期，减少副作用。使用超高压技术从人参中提取人参皂苷，确定了其最佳工艺条件，并与微波辅助提取、超声辅助提取、索氏提取、热回流提取相比较，结果表明，超高压提取在产品得率、提取时间和能耗方面均优于其他方法。同时，研究还发现在同样的皂苷浓度条件下，热回流提取法和超高压提取法展现出相近的清除自由基能力，优于其他几种方法。虽然超高压提取后的皂苷自由基清除能力不是最高，但是由于其高效的提取效果使得超高压提取后的皂苷含量最高，因此依然具备较好的自由基清除能力。探讨了不同提取溶剂、溶剂浓度、提取压力、溶剂与原料比、提取时间等因素对皂苷得率的影响，确定了超高压提取西洋参根中皂苷的最佳条件，并将超高压提取法与热回流提取、微波提取、超声提取、超临界CO2萃取等方法进行了比较。超高压提取西洋参根中皂苷的最佳提取条件为：70%乙醇水溶液为提取溶剂，提取压力为200MPa，溶剂与原料比为50:1，提取时间为2min。超高压提取西洋参根中的皂苷具有提取得率高、时间短、能耗低等优点，因而采用超高压技术进行西洋参皂苷的提取具有更大优势。经过大量的试验对比，超高压技术不仅在提取时间和提取得率上具有明显优势，在提取产品的清除自由基能力方面也要优于热回流提取、超声提取、微波提取等方法。超高压技术的出现为皂苷类化合物的提取提供了新的思路。尽管超高压技术在中药有效成分的提取方面具有很多独特的应用，但其应用研究还处于起步阶段，还有很多工作要做，如提取工艺参数协同效应的优化等问题尚需进一步深入研究。4.3

黄酮类化合物提取黄酮类化合物也称黄碱素，多以糖苷形式存在，作为二级代谢产物广泛分布于各种植物中，截至目前已发现的黄酮类化合物高达8000多种。黄酮类化合物是天然产物中生物活性较高的一类有效成分，许多中药或中成药都选用黄酮类化合物作为质量控制指标。黄酮类化合物具有多种生理活性，人体摄入后可产生抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、保护心血管系统、调节机体免疫及炎症反应等功效。与皂苷类化合物相同，黄酮类化合物也大多采用传统的提取方法，而将超高压技术应用于黄酮类化合物的提取，不仅能大大缩短提取时间，还可以提高黄酮类化合物的提取率。纵伟[26]等应用超高压技术提取金银花中的总黄酮，考察了压力、提取时间、固液比和原料粒度对总黄酮提取率的影响，得到最佳提取条件为：提取压力360MPa、提取时间5min、固液比1:14、原料粒度80目，总黄酮提取得率最高达13.56%。同时将超高压提取法与热醇浸泡提取法、微波提取法、超声提取法进行比较，其总黄酮得率分别为13.56%、10.32%、11.21%和12.02%。由此可见，超高压提取方法得率高、时间短，是一种提取金银花中总黄酮的较好方法。试验在常温条件下进行，避免了因热效应导致的有效成分结构发生变化以及生理活性的降低。研究同时发现，随着超高压提取金银花总黄酮浓度的增加，DPPH自由基的清除率也随之增加，呈现良好的线性关系，说明超高压提取的总黄酮具有较高的抗氧化能力。选用L9（34）正交实验法优化超高压提取山楂叶中黄酮类化合物的最佳工艺，并用分光光度法检测山楂叶中黄酮类化合物的含量。结果表明，超高压提取山楂叶中黄酮类化合物的最佳提取工艺参数为：提取溶剂为50%乙醇，提取压力400MPa，料液比为1:45，提取温度60℃，提取时间3min。同时，超高压提取技术还具有提取效率高、时间短、杂质含量少等优点。通过响应面法对超高压提取金鸡菊总黄酮的工艺进行了研究，同时将热回流提取法与超高压提取法进行比较，发现超高压提取得率较高且用时短。对这两种方法提取的黄酮进行紫外可见光谱分析和红外可见光谱分析，发现这两种样品的光谱图均重叠，表明两者为同一物质，说明超高压技术不会破坏金鸡菊总黄酮的结构。采用超高压技术提取山楂黄酮，同时与索氏提取法、超声提取法相比较，研究发现，超高压技术有明显的优势，有利于得率的提高，且避免了提取过程中产生热效应。为了更好地解释超高压技术有利于黄酮的提取，利用发射扫描电镜观察提取前山楂黄酮干燥粉末以及经索氏提取和超高压提取后烘干的残渣粉末，结果显示，超高压提取后的残渣颗粒表面的孔隙比索氏提取后的更多、更大，组织结构破坏更加严重，且比表面积增加，这些变化正是超高压提取山楂黄酮具有较高得率的主要原因。4.4

多酚类化合物提取多酚是四种主要次级代谢产物之一，存在于一些常见的植物性食材中，例如水果、蔬菜、谷类食物、豆类、坚果等。多酚类物质的种类繁多，结构各异，多以复杂的混合物形式存在，目前科学界已经分离鉴定出8000多种多酚类物质，如苹果中的根皮苷、葡萄中的甘藜芦醇、柿子中的单宁等。多酚类物质被称为“第七类营养素”，其主要活性成分为多酚类化合物。多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称，包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等。多酚类化合物的共同特点是具有良好的抗氧化活性，能与维生素C、E和胡萝卜素等其他抗氧化物在体内一起发挥抗氧化功效，清除有害人体健康的坏分子——自由基。因此，多酚具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉硬化以及防治冠心病、高血压、糖尿病等的生物活性。采用响应面法对蓝靛果多酚超高压提取条件进行了优化，结果表明，响应面法优化超高压提取条件为：料液比1:19、提取温度30℃、提取压力406MPa、超高压时间11.5min、乙醇体积分数50%，此条件下多酚提取量最高，达（78.23±3.45）mg/100g果浆。将超高压提取法和超声波提取法进行比较可得，尽管超高压提取缩短了蓝靛果多酚提取时间，且提取的多酚活性高，但受到容器大小的限制，在大批量提取蓝靛果多酚的情况下，超高压提取的效率和提取量仍然不及超声波提取。因此，从多酚提取量和提取效率的角度考虑，超声波提取蓝靛果多酚优于超高压提取。采用超高压技术在常温下从茶叶中提取茶多酚，并通过正交试验法，以茶多酚粗品收率为指标，考察了溶剂浓度、压力、保压时间、浸泡时间对茶多酚的影响。研究表明，超高压提取茶多酚的最佳工艺条件为：溶剂60%乙醇，压力200MPa，浸泡时间0.5h，保压时间3min，得率为28.92%。同时比较了回流提取法与超高压提取法，得到超高压提取的粗品收率比回流提取的收率高25.3%，茶多酚的收率则比回流提取高32%。超高压提取不但比回流提取收率高，并且提取液澄清、透明，存放一年半后毫无变化。4.5

其他天然活性成分提取超高压技术除了应用到上述多糖、皂苷、黄酮及多酚类化合物的提