2024禽白血病诊断技术

禽白血病诊断技术PAGEPAGE10禽白血病诊断技术范围ALVALV特异血清抗体的检测方法。ALV感染。本标准适用于禽白血病诊断规范性引用文件（包括所有的修改单适用本文件。GB/T18088-2000 出入境动物检疫采样GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法NY/T680-2003 p27抗原酶联免疫吸附试验方法术语和定义禽白血病病毒 avianleukosisvirus；ALV禽白血病病毒为反转录病毒科的α（Marek’sdisease（ReticuloendosiliosisVirus，REV）外的又一类重要的致肿瘤病毒。ALV可分为A-K11个亚群，其中仅A、B、C、D、E、J、K亚群病毒与鸡相关。A、B、C、D、J、K亚群属外源性ALV，与鸡白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群ALV基因组可完整地整合进感染鸡的染色体基因组并稳定地遗传下去，也可从中再复制出传染性病毒颗粒，称为内源性ALV。间接免疫荧光试验 immunofluorescentassay；IFA（抗抗体酶联免疫吸附试验 enzyme-linkedimmunosorbentassay；ELISA免疫胶体金技术 Immunecolloidalgoldtechnique；GICT是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。设备和材料4.1 冰箱：-20，-80℃。4.2 恒温培养箱：36℃±1。4.3 冷冻台式离心机（≥12000r/min）。4.4 恒温水浴锅：36℃±1℃4.5 摇床：36℃±1℃。CO2培养箱。正置荧光显微镜。SPF鸡隔离器。微量移液器及吸头（10μL、100μL和1000μL）。离心管（1.5mL、15mL和50mL）。细胞培养瓶（T25、T75）。细胞培养皿（60mm直径、90mm直径）。96孔细胞培养板。基因扩增仪。电泳仪和水平电泳槽。凝胶成像仪。锥形瓶。棉棒。低温恒温水槽（16℃）。电子天平（0.0001g）。组织研磨器。材料和试剂DMEM液体培养基（pH7.2）。胎牛血清或小牛血清。细胞生长液（含有体积百分比5％胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）。细胞维持液（含有体积百分比1％胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）。5.5 0.25％胰酶。青霉素（10000U/mL）和链霉素（10000μg/mL）、制霉菌素（5μg/mL）。参考株（NX0101株，GenBankNo:DQ115805）。参考株（SDAU09C3株，GenBankNo:HM452340）。参考株（JS11C1株，GenBankNo:KF746200）。单克隆抗体。抗ALV单因子血清。异硫氰酸荧光素（FITC）IgGIgG抗体。ALV-p27抗原ELISA检测试剂盒。ALV-JELISA抗体检测试剂盒。ALV-AbELISA抗体检测试剂盒。抽提缓冲液。蛋白酶K。生理盐水（0.9％NaCl水溶液）。无水乙醇（分析纯）。丙酮、甘油、乙酸钠、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇（分析纯）。75％酒精。碘酒。磷酸盐缓冲液溶液（0.01mol/LPBS，pH7.2）。聚合酶链式反应（PCR）试剂。反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂。大肠杆菌（TGl）。10×加样缓冲液。琼脂糖。DL2000DNAMarker。TAE电泳缓冲液。氯化钙（0.1mol／L）。双蒸水。LB液体培养基。TE缓冲液。RNase。细胞裂解液。0.1％的焦碳酸乙二酯（DEPC）水。临床诊断临床症状ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率、发病率和死亡率高低不等，死亡率最高可达20%。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降、生长抑制和免疫抑制。除表现为骨化石病的白血病患鸡腿骨等长骨变粗变短等特殊症状外，其它病型很少显示特异的临床症状。病理变化（块状或米粒状成红细胞性白血病、成髓性细胞白血病、髓细胞白血病，多使肝、脾、肾呈弥漫性增大。JALVH.EMDVREV诱发的REV诱发的类似肿瘤细胞相区别，也要与嗜中性白细胞浸润性炎症相区别，如在鸡戊型肝炎病毒（HEV）感染引起的肝局部炎症。确诊须以肿瘤组织中的病毒抗原检测或病毒分离鉴定为依据。病毒的分离培养、检测和鉴定分离病毒用细胞鸡胚成纤维细胞（CEF）CEF制备方法见附录A。鸡胚成纤维细胞自发永生株（DFl）细胞DFl细胞培养基制备方法见附录B。样品的采集与处理全血、血清或血浆取疑似病鸡的全血、带有白细胞的血浆或血清，无菌接种于长成单层的CEFDFl5％CO237℃恒温培养箱中培养。脏器1倍～2（含青霉素和链霉1000IU／mL）4℃，10000r／min离心5min，收集上清液。接种细胞培养或-80℃保存备用。咽喉、泄殖腔棉拭子3次～531.5mL磷酸盐缓冲液的无菌离心管中(1000IU／mL)，盖上管盖并编号，4℃，10000r／min5min，收集上清液。病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养CEFDF137℃、5%CO2的细胞培养2hPBS（0.01M，pH7.4）洗涤细胞，然后每孔更换500μL37℃、5CO25d～7d。细胞传代：将7.3.1.1培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养5d～7d。病毒的鉴定间接免疫荧光抗体反应(IFA)固定将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酮-乙醇(6﹕4)混合液，覆盖单层细胞为宜，室温固定5min，待其自然干燥，用于IFA，或置于-20℃保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。加第一抗体用0.01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)将单克隆抗体(如抗ALV-J亚群特异性单克隆抗体)或抗ALV单因子鸡血清(抗ALV单因子鸡血清的制备见附录C)稀释到工作浓度，在37℃水浴箱作用40min，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。加FITC标记二抗按商品说明书用磷酸盐缓冲液稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗鸡IgG抗体(当第一抗体为ALV特异性单克隆抗体，选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体；当第一抗体为鸡抗ALVFITC标记的山羊抗鸡IgG抗体作为第二抗体)37℃水浴箱作用40加甘油滴加少量50％甘油磷酸盐缓冲液于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。结果观察与判定CEF或DF1200×～400CEF或DF1ALVALV-p27抗原ELISA检测抗原样本制备将不同样品按照7.2所述方法接种细胞，培养7d～14d后取上清液直接检测；也可取细胞培养物冻融后检测。p27抗原ELISA检测按照NY/T680-2003或采用符合NY/T680-2003结果判定DFl或CEF(C／E品系)细胞上清液检测出ALV-p27抗原时，判为外源性ALV阳性，否则判为阴性。普通CEF细胞上清液检测出ALV-p27抗原时，无法区分是否有外源性ALV或内源性ALV，需转接DFl细ALV-p27ALVALV-p27抗原免疫胶体金试纸卡检测抗原样本制备将不同样品按照7.2所述方法接种细胞，培养7d～14d后取上清液直接检测；也可取细胞培养物冻融后检测。p27抗原免疫胶体金试纸卡检测2℃~8（20℃~25℃）放置约30min结果判定根据附录E（C线（T线ALV阳性，否则判为阴性。ALV-p27ALVALV或内源性ALV。ALV亚群鉴定按照7.3.2.1方法，利用J亚群ALV特异性单克隆抗体进行IFA检测，可以鉴定J亚群ALV，但不能鉴别其他ALV亚群如A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、K亚群。对分离到的病毒用RT-PCR(上清液中的游离病毒)或PCR(细胞中的前病毒cDNA)扩增和克隆囊膜蛋白env基因，测序后与基因序列数据库(GenBank)中的已知ALV的A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、EJ亚群和K亚群的envALV病毒分群方法见附录F。PCRALV-J该方法适用于鸡群的快速检疫或ALV-J血清特异性抗体的检测ELISA检测可选用禽白血病A亚群、B亚群及J亚群抗体ELISA检测试剂盒，严格按商品提供的说明书操作和判定。IFA检测抗原抗原制备方法见附录H。操作步骤在相应的盖玻片上或抗原孔中加入用磷酸盐缓冲液37℃下作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤三次。再加入工作浓度的FITC标记的山羊抗鸡IgG抗体(第二抗体)，在37℃作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加少量50％甘油磷酸盐缓冲液后在荧光显微镜下观察。结果的判定结果的判定方法同7.3.2.1.5SPFABK亚群及J亚群抗体阳性的鸡，表明该群体可能曾经有过外源性ALV感染，确诊需按照7.3进行病毒分离鉴定。综合判定疑似89感染可疑病例。确诊符合7.3经DF1细胞或CEF(C／E品系)细胞病毒分离为阳性结果时，判定被检样品来自于外源性ALV感染鸡群。经7.4确定亚群的，可判定被感染鸡群感染外源性ALV的亚群。附录A（规范性）0系SPF鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备9~10SPF鸡胚。先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，DMEMDMEM2~30.25%胰酶溶液（每个鸡胚约37.5℃~38.5℃10~15min（DMEM200IU/mL~500IU/mL）4层纱布或一次性铜1000rpm5min。将细胞沉淀再混悬于细100~150T25培养瓶（皿）中，进行培养。形成单层后备用（24h内应用）。附录B（规范性）DF1细胞培养基配制DMEM5%胎牛血清pH7.2250IU/mL。培养条件：37℃，5%CO2。附录C（规范性）抗ALV单因子鸡血清的制备（cDNA克隆质DNASPFCEFDF1C/ECEF后复制和扩增病毒。51%DMEM维72~96h后收取上清液（通常可达到最高病毒效价），1ml，于-80℃冰箱保存。2～310倍系列稀释后，分别接种于含有新鲜配制（837℃6PBS-（6﹕4）的单克隆抗体进行7.3.2.1）TCID50量。6SPF104TCID504～6周后采集血清。抗体滴度应≥1：100。附录D（规范性）试纸卡结构示意图D.1禽白血病抗原胶体金试纸卡结构示意图附录E（规范性）试纸卡结果判定方法示意图图E.1禽白血病抗原胶体金试纸卡结果判定示意图克隆载体和宿主菌

附录F（规范性）ALV亚群鉴定程序商品化的PCR产物克隆载体质粒，或其他类似载体质粒。可用多种大肠杆菌作为宿主菌，如TGl等。病毒模板的制备按照以下程序或商品化细胞DNA提取试剂盒说明书提取细胞DNA。30.255min-10min，1.5mL离心管中。2000r／min离心收获细胞，然后加入500μL抽提缓冲液(100mmol／L氯化钠，10mmol／LTris.Clmmol／LpH8.0，0.5％SDS)5μLK1005h。加入等体积的苯酚-三氯甲烷溶液(苯酚﹕三氯甲烷﹕异戊醇=25﹕24﹕1)500μL抽提一次，将1.5mL1/103mol／L2倍体积无水乙醇后，置于-202h或者更长时间。12000r／min10min70DNA沉淀，弃去上清液。DNA50μLDNA。env基因的扩增引物可根据已发表资料合成扩增ALV-J的前病毒DNA特异性PCR引物，本例示范引物为：正向引物：5’-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT-3’，相当于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基DNA5394对～5416对碱基。反向引物：5’-AGTTGTCAGGGAATCGAC-3’，相当于HPRS-103DNA7811对～7794对碱基。引物用双蒸水稀释25pmol／μL，-20℃保存备用。PCRDNA的囊膜蛋白基因(env)2.2kbPCR反应体系(50μL)见表F.1。表F.1ALV-Jenv基因PCR反应体系组 分体积/μL双蒸水30.510×缓冲液(无Mg2+)(成分：100mmol/LTris.ClpH8.0，500mmol/L氯化钾，1％明胶)5.0氯化镁(15mmol/L)4.0dNTPs(2.5mmol/L)4.0正向引物(25pmol/μL)2.0反向引物(25pmol/μL)2.0DNA聚合酶(5U/μL)0.5模板DNA(约100ng/μL)2.0总体积50.0PCRPCR首轮循环：95℃5min；中间循环：95℃1min，50℃1min，72℃2min30s，进行30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCRDNA电泳4.5μLPCR0.5μL10×进样缓冲液(0.25％溴酚蓝，0.25％甲苯苯胺，15400)0.85μLDL2000DNAMarkerV50minPCR产物的回收与定量可采用商品化PCR产物回收试剂盒进行回收。PCR产物的克隆连接反应将载体与纯化回收PCR产物于16℃下连接6h～8h。连接体系为：载体 25ng纯化env基因PCR产物 100ng溶液I 5μL加双蒸水至 10μL质粒转化用感受态大肠杆菌的制备用氯化钙法制备大肠杆菌TGl菌株的感受态细胞，步骤简述如下：50mLLBTGl37℃恒温振荡器中振荡培养至半浑浊半透明状态。在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的-2050mL10min，使0℃。44000r／min10min，回收细菌细胞。1min，以使残余的培养液流尽。10mL0.1mol/L30min。44000r／min10min，回收细菌细胞。1min，以使残余的培养液流尽。50mLlmL0.1mol／L氯化钙重悬每份沉淀，4℃保存备用。质粒的转化将F.4.1中得到的连接产物转化大肠杆菌，步骤简述如下：10μL200μLTGl感受态细胞中，混匀内容物，冰浴上放置30min。4290s。2min～3min。LB80037℃摇床上(22045200μL100μg／μLLB琼脂平板上。3712hDNA的制备与鉴定。DNA的提取和鉴定DNA的提取50μg／mL5mLLB37℃6h，提取质粒。1.5mL11mLTE缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。100μLI，在振荡器上强烈振荡混匀。200μL溶液Ⅱ(5min，溶液Ⅱ需现配)5次(不要强烈振荡)，冰浴中放置3min。150μL10s3min～5min。12000r／min5-12000r／min5min2倍体积的无水乙醇。12000r／min10min～15min1mL70DNA沉淀。50μLTE0.5μL～lμLRNase。-20℃保存备用。DNA的酶切鉴定以质粒上带有的酶切位点使用相关内切酶进行双酶切鉴定。酶切体系如下：总体积质粒DNA双蒸水20μL10μL7μL10×缓冲液K2μLEcoRI0.5μLHindⅢ0.5μL以上组分混匀后，轻微离心，372h0.890V45min，在凝胶成像系统下观察并记录结果。克隆序列的测定EcoRIHindGenBank的A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、E亚群、JKenv基因做同源性比较分析，并确定属于哪个亚型。可参考的GeneBank中序列编号分别为：M37980DQ365814(A亚型)；A052428(B亚型J0234(C亚型)D1065(D亚型12172467236和Y1333(E亚型46390、AF247391、DQll6805、EU264064(J亚型)；KY773911MG770235(K亚型)A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、KE90％，与哪个JJ亚群序列的同源性大于80％。附录G（规范性）荧光PCR扩增ALV-J试剂引物和探针序列:选择ALV-J特异性env基因序列作为ALV-J检测的靶序列，产物长度为138bp。上游引物：5AGAAAGACCCGGAGAAGAC3’;下游引物：5’ACACGTTTCCTGGTTGTT3’;TaqMan探针：5’ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ。样品采样和前处理样品采样和前处理见7.2。PCR检测注意事项实验室注意事项参见规范性附录I。核酸抽提可选用市售商品化核酸抽提试剂盒或按如下步骤抽提核酸。取n个灭菌的1.5mLEppendorf管编号（n为被检样品与阴性对照、阳性对照之和）。每管加入600µL200200µL氯5s（412000r/min离心15min。取与E.3.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入400µL异丙醇（-20℃预冷），做标E.3.2.2500于412000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置(不同样品须在吸水纸不同地方沾干600µL75于4℃12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5min～10min。加入15µLDEPC（焦碳酸乙二酯RNA，5000r/min离心5扩增检测扩增试剂准备J亚群禽白血病病毒一步法荧光定量RT—PCR检测试剂盒(参见附录J)000r/min离心5s，每个PCR反应体系按表G.1所示用量配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照+1)。表G.1 PCR反应体系试 剂用量/µLRT-PCR反应液14.5Taq酶（5U/µL）0.25逆转录酶0.25将以上PCRPCR管中分装15µl，转移至样本处理区。加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸10µl，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。PCR扩增检测反应条件第一步：42℃30min，95℃5min；第二步：95℃10s，55℃10s，72℃30s，5个循环；第三步：95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃时设置采集荧光。荧光素设定报告基团（reportdye）设定为FAM，淬灭基团（quenchdye）设定为BHQ（或Tamra或Eclipse），Referencedye设定为None。分析条件设定及结果判定质控标准（threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。ALV-J阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照有S型PCR扩增曲线，而且Ct值（每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数S型PCRCt值为无。否则此次实验结果无效。结果判定及描述有S型PCR扩增曲线，且Ct值≤30的样本为阳性，表明ALV-J核酸阳性。无S型PCR扩增曲线，且Ct值为无的样本为阴性样本，表明ALV-J核酸阴性；对于30＜Ct值＜40的样本建议对样品进行复检。若复检后，Ct值＜40，判为ALV-J核酸阳性，否则判为阴性。样品中ALV-J核酸阳性，表明相应样品中检出该病毒，相应鸡有ALV-J感染。附录H（规范性）IFA法抗体检测用ALV感染细胞的制备DF1CEF(C／E)单层细胞的细胞瓶或培养皿中接种0.5mL103TCID50如5h1DMEM培养基继续培养。5d后将细胞单层用胰酶(A)5％胎牛血DMEM5×1055mL细96100µL374d96孔细胞培养板弃去培养基，在磷酸盐缓冲液中漂洗一次后，滴加预冷的丙酮-乙醇(6﹕4)固定液室温固定5min。自然干燥后，用塑料薄膜包裹后置-20℃保存。附录I（资料性）J亚群禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的实验室规范实验室设置要求PCR每一区域须有专用的仪器设备，并且明确标识。PCR反应混合物配制区至检测区。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作