2024禽流感诊断技术

禽流感诊断技术目 录范围 3规性用件 3缩语定义 3临诊断 4样采、存运输 5病分与定 5血素集血素制（HA和HI）试验 6禽感毒RT-PCR验 7禽感毒时光RT-PCR验 8合定 9附录A（规性试用溶和1%细的制 10附录B（资性血特异凝和特性制因的理法 12附录C（资性高性禽感毒IVPI测验 14附录D（资性禽病毒RT-PCR验引物 16附录E（资性）RT-PCR反液制 17附录F（资性实光RT-PCR引探序反应配方 181禽流感诊断技术范围（（HA和RT-PCRRT-PCR本文件适用于禽流感（包括高致病性禽流感）的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。（GB/T19489 实室 物安通要求NY/T765 下列缩略语和定义适用于本标准。3.1禽流感avianinfluenza；AI由正黏病毒科ɑ流感病毒属的病毒（A型流感病毒）引起的一种以禽类为主的感染和/或疾病综合征。3.2高致病性禽流感highlypathogenicavianinfluenza；HPAI由高致病性A型流感病毒，通常是由H5或者H7亚型，引起的以禽类为主的急性传染病。3.3血凝试验haemagglutination；HA利用流感病毒表面的血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白具有结合红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性而开展的红细胞凝集试验（haemagglutination，HA），可以用来检测流感病毒的含量。3.4血凝抑制haemagglutinationinhibition；HI特异性抗体结合到流感病毒血凝素蛋白的抗原位点后能够抑制流感病毒血凝素与红细胞受体之间3.53静脉内接种致病指数intravenouspathogenicityindex；IVPI一种判定流感病毒致病能力高低的方法。见附录C。3.6反转录-聚合酶链式反应reversetranscription-polymerasechainreaction；RT-PCR一种用于放大扩增特定的RNA片段的分子生物学技术。先用反转录酶将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增的过程。3.7实时荧光RT-PCRreal-timeRT-PCR利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的一种扩增核酸方法。3.8Ct/Cp值thresholdcycle/crossingpoint每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数。4.2.2出现4.2.1中的情况，初步判为低致病性禽流感临床可疑病例，需要进一步开展鉴别诊断。出现4.2.2、4.2.3、4.3中的情况，初步判为高致病性禽流感临床可疑病例，需要进一步开展实验室诊断。4NY/T765/2～32～31.2mLA.1）2mL10g无菌采集禽类的血液，每只约2mL，编号并填写相应采样单。待血液凝固，血清析出后，收集血清用于HI检测。5.6样品保存和运输24h44d(-70AIVHPAIVGB/T19489将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子；粪便、研碎的组织加样品稀释液充分研磨，配成10%(g/mL)的悬液。样品液经3000r/min离心10min，取上清作为接种或者核酸检测材料。0.2mL/9d～11d(SPF℃孵化箱内孵育，18h后每天上午和下午定点观察鸡胚死亡情况。无菌收取18h72hHA活性。若无HA活性，则收取尿囊液进行盲传，至少盲传1代，若仍无HA活性，则认为病毒分离阴性；若有HA活性说明可能有正黏病毒科的流感病毒，可进一步采用血凝素凝集和血凝素抑制（HA和HI）试验(见5第7IVPICRT-PCRRT-PCR9（HA）（HI）试验血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验方法适用于HA亚型的判定和抗体效价测定。(Alsevers)A.2。1%（V/V）A.3。pH7.2、0.01mol/LPBSA.4。HAHA96V0.025mLPBS。l0.025mL10.025mL20.025mL3211110.025mL12PBS0.025mLPBS。0.025mL1%（V/V）2040min25℃时）460min60º（100）HIHA44HAU）示例：1:256（288log2），4HAU=256/4=64（1∶64）；PBS6.3mL0.1mL1∶644HAU4HAU1∶641∶21∶31∶41∶5、1∶61∶70.025mLPBS0.025mL1%鸡红细0.025mL（20℃）40min460min4HAU，1∶44HAU1∶51∶61∶2134HAU。1～110.025mLPBS120.05mLPBS10.025mLB）1PBS0.025mL2210100.025mL111～110.025mL4HAU20）30min4℃60min。0.025mL1%（V/V）20℃）40min60min（126111∶4（22214HAUHI/HI1∶8（233log2）1∶16（244log2）HI≥1∶16（244log2）HI1∶8（233log2）H5RT-PCR适用于检测禽组织、分泌物、排泄物、鸡胚培养物等样品中禽流感病毒核酸。8.2.1PCR扩增仪及配套反应管。8.2.2（12000r/min）。8.2.3II级生物安全柜。8.2.4（5、10、100、1000L）1.5mL离心管。8.2.5电泳仪。8.2.6电泳槽。8.2.7紫外凝胶成像仪。推荐的禽流感病毒RT-PCRD.1。RT-PCR反应液，配方参见附录E.1。无核酸酶水，配方参见附录E.2。SPFRNA可选市售商品化RNA提取试剂盒，按说明书进行。RT-PCR取2.5µL（约250ng）RNART-PCRPCR：4545min；942min；94℃3052℃45、6845s，3568℃延伸8min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。7RT-PCR实时荧光RT-PCR适用于检测禽组织、分泌物、排泄物、鸡胚尿囊液等样品中禽流感病毒核酸。PCR仪。9.2.2其余器材同8.2.2～8.2.4。推荐的实时荧光RT-PCR引物探针序列参见附录F.1。可选市售商品化RNA提取试剂盒，按说明书进行。RT-PCRRT-PCR宜在专门的配液区配制实时荧光RT-PCR扩增反应液。根据需要检测的样品数，按推荐的实时荧光RT-PCR反应液配方,参见附录F.2，配制反应液，充分混匀后分装，每个反应管15μL。转移反应管至样本制备区。加样9.5.19.4RNA5μL(约500ng20μL，500r/min30。RT-PCRRT-PCR9.5.2RT-PCRnone。推荐的实时荧光RT-PCRF.3。综合分析仪器读取的各项数据及扩增曲线，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），使仪器显示正确的结果。阴性对照检测通道读取数据无Ct/CpCt/Cp30。Ct/Cp30830＜Ct/Cp35Ct/CpCt/Cp35疑似临床上出现4.2.2、4.2.3、4.3中的情况，初步判为高致病性禽流感临床可疑病例，经非参考实验室检测，M基因的RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测阳性，H5或H7亚型检测阳性，可判为高致病性禽流感疑似病例，M基因的RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测阳性，H5或H7亚型检测阴性，可判为低致病性禽流感病例。确诊HAHIIVPI值大于IVPI1.2的H5或H7HA（OFFLU）9附录A（）试验所用溶液和1红细胞的配制A液：0.2ol/LaHOHO2.6g1000。B液：0.2mol/LNa2HPO4·7H2O53.6gNa2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）加蒸馏水溶解，最后定容至1000mL。0.01mol/LpH7.2（PBS）（A14，B液36NaCl8.51000121℃±2℃，15min2000（2（50（1000U/mL）（5mg/mL）。上述抗生素浓度宜用于组织和咽喉拭子，如果用作粪便和泄殖腔拭子的缓冲液，抗生素可提高5倍。（Alsevers）2.050.80.0550.420100pH6.1，69kPa15min41采集至少三只SPF鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.20.01mol/LPBS31000r/min10minPBS1%（V/V）1SPFpH7.20.01mol/LPBS31000r/minPBS2%5%PBS5min3PBS1%（V/V）醛化红细胞悬液，置2～8℃保存备用。pH7.2，0.01mol/LPBS25×PB2.74g0.79g100。1×PBS40mL25×PB8.5g1000。c）pH7.2。10PBS2～8211附录B（资料性）血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法）HA0.5mL0.025mL5030min，800×gmin～5min（HI1HAHI--取03mL0.15mL（8g/200g的P250胰酶溶解于5mL的0.01ol/，pH值7.0∼7.2PBS−15630min0.9mL230mgKIO40.01mol/L，pH7.0～7.2PBS1周）15。0.9mL（1mL99mL0.01mol/L，pH值7.0～7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存），混合，室温孵育15min。0.75mL410（RDE）处理法1（50μL）4体积RDE（200μL），3718h（）。5（2501.5%5630）。150%10RDE（50μL+500μL血清41hd)1000g离心10min，小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。HI2～110.025mLPBS120.05mLPBS120.025mL2PBS0.025mL3孔，210100.025mL1112第1～11.025m4U（约2040in或4℃0i。0.025mL（2040min或4℃60min1∶10，14HAUHIHI1∶101∶10（1∶10）13附录C（）高致病性禽流感病毒IVPI测定试验6周龄SPF鸡，10只。1∶16（244log2）1∶100.110d。0123//1IVPIC.1C.1。表C.1 设致性感病致性验录果临床症状D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10分类总计得分正常（a=0）10533210000240病鸡（b=1）000000000000重病鸡（c=2）05201110001020死亡（d=3）005778910101066198总计//////////100218注1：当IVPI值大于1.2时，判定分离株为高致病性禽流感病毒（HPAIV）。注2：本试验中IVPI＝（0+0+20+198）/100＝2.18＞1.2，因此，本试验中的分离株为HPAIV。IVPIIVPI值计算参见公式（C.1）IVPI＝ Σa×0＋Σb×1＋Σc×2＋Σd×3 （C.1）T14式中：Σa——10d累计正常鸡数；Σb——10d累计病鸡数；Σc——10d累计重病鸡数；Σd——10d累计死鸡数；T——10d累计记录10只鸡的总次数,即100。当IVPI1.2(HPAI)当IVPI1.2时，和H7HA15附录D（）禽流感病毒RT-PCR试验用引物D.1禽流感病毒RT-PCR试验用引物采用普通RT-PCR方法开展禽流感检测，可根据检测目的基因不同选择参见表D.1中的引物。表D.1禽流感病毒RT-PCR试验可选择的引物引物名称引物序列5′--3′长度bp扩增目的基因M-229UTTCTAACCGAGGTCGAAAC229MM-229LAAGCGTCTACGCTGCAGTCCH5-372UGGAATATGGTAACTGCAACACCA372H5H5-372LAACTGAGTGTTCATTTTGTCAATGH7-501UAATGCACARGGAGGAGGAACT501H7H7-501LTGAYGCCCCGAAGCTAAACCAH9-273UTGTGTCTTACGATGGGACAAGCA273H9H9-273LTTGACAAGAGGCCTTGGTCCTATN1-358UATTRAAATACAAYGGYATAATAAC358N1N1-358LGTCWCCGAAAACYCCACTGCAN2-377UGTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG377N2N2-377LGAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCAN9-203UATAATGAAACAAACATCACCAA203N9N9-203LAGCATAGAACCTGCATTCATCT注：W=(AT)；Y=(CT)；R=(AG)。16附录E（资料性）RT-PCR反应液配制RT-PCR每个RT-PCR反应体系包括的组分参见表E.2。表E.2RT-PCR反应液配方组分1个检测体系的加入量µL5×反应缓冲液5.010mmol/LdNTP0.515mmol/L氯化镁1.020pmol上游引物0.520pmol下游引物0.5AMV反转录酶(200U/μL)0.5TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5无核酶灭菌水14.0DEPC0.112h(121±2)℃高压30min17附录F（）实时荧光RT-PCR引物探针序列及反应液配方采用荧光RT-PCR方法开展禽流感检测，可根据检测目的基因参见表F1提供的序列由公司合成引物和探针，纯度为HPLC级，用RNase-Free灭菌水溶解并稀释至终浓度10μmol/L，-20℃保存备用。表F.1禽流感病毒荧光RT-PCR试验可选择的引物和探针引物和探针名称序列(5′-3′)M上游引物1GACCRATCCTGTCACCTCTGACM下游引物1AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTAM探针1FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1H5上游引物AGGGAGGATGGCAGGGAATGH5下游引物TCTTTGTCTGCAGCGTACCCACTH5探针FAM-ATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATG-BHQ1H7上游引物CTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAH7下游引物AATTGCCGATTGAGTGCTTTTH7探针FAM-CAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCT-BHQ1N1上游引物AAGRTTTGAGTCTGTTGCTTGGTCN1下游引物CYCCATTGTCTGGACCAGAAATN1探针FAM-CAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAGTTGGTT-BHQ1N6上游引物TGCAGGATGTTTGCTCTGAGTCN6下游引物CGAAATGGGCTCCTATCATGTATN6探