牛出血性败血症诊断技术-编制说明

一、工作简况

（一）修订和研究基础。

现行的牛出血性败血病诊断标准为国家标准《牛出血性败血病诊断技术》（G

B/T27530-2011），其针对牛出血性败血病的临床与病理学诊断以及病原的分离

与鉴定进行了技术规定。但是，现行的国家标准中的病原鉴定包括生化鉴定与血

清分型试验，操作起来比较繁琐，与核酸检测技术相比准确性与特异性不高，严

重制约了我国多杀性巴氏杆菌的流行病学调查和流行代表株的筛选，进一步阻碍

了新型疫苗的研发。因此对标准《牛出血性败血病诊断技术》进行修订，增加多

杀性巴氏杆菌多重PCR分型技术标准，以填补国内多杀性巴氏杆菌病检测的空

白，为我国牛多杀性巴氏杆菌病的防控及扑灭提供依据。

多杀性巴氏杆菌(P.multocida,Pm)是牛出血性败血症的病原，该病原在国内

养牛场的广泛流行，给养牛场造成重大的经济损失。2008年以前，引起牛出血

性败血症的主要是荚膜血清B群菌株。随着牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗（主

要成分为灭活的荚膜B群多杀性巴氏杆菌）的推广应用，近年来临床上分离到

的B群Pm菌株逐渐减少。现有资料表明，近10年来临床上分离到的荚膜血清

A型Pm逐渐增多，并有D、E、F型Pm分离株的报道。相对于其他细菌性疾病

来说，巴氏杆菌病的潜伏期比较长，因此，在巴氏杆菌病的预防控制工作中，应

尽可能消除巴氏杆菌的传染源。由于目前没有针对荚膜A型Pm的疫苗，而现有

的牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对A型菌株的交叉保护率低于30%，所以在养殖

过程中一旦发现其染上巴氏杆菌病，应立刻采取治疗措施。因此，分离菌株的分

型与鉴定是制定针对性的防治措施以及疫苗研发的基础。

现行国家标准（GB/T27530-2011）规定的分型方法包括间接血凝试验（IH

A）、琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、对流免疫电泳试验（CIEP）。传统的分型

方法比较繁琐，操作时间比较长，而且受试验材料限制可能出现无法分型的现象，

如间接血凝试验必须用具有凝集性的抗血清进行鉴定，若与所有血清都没有发生

凝集反应，则无法用该方法对菌株进行分型，而且IHA针对B型和E型菌更有

效；进行琼脂凝胶免疫扩散试验时所有能引起HS的血清型菌株均能与2型抗血

清反应，与5型抗血清也能发生交叉反应，从而出现误判。PCR技术具有快速、

准确、灵敏以及操作简便、灵活等特点，在临床检测上得到了广泛应用。2001

年澳大利亚学者建立了Pm种和5个荚膜血清型的6重PCR检测方法，该方法

检测效果良好并在全球得到推广和应用，而且已经被世界动物卫生组织（OIE）

采用用于巴氏杆菌的分型鉴定。目前世界各国学者在澳大利亚学者建立的方法基

础上，根据本国Pm的流行特点，优化并建立了适用于本国Pm流行病学调查的

PCR检测方法。2015年澳大利亚学者基于Pm的脂多糖（LPS）基因建立了基因

分型8重PCR，2016年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在其基础上改进并建

立了一种LPS-mPCR。本文件的修订参考了OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准

手册》中的多杀杆菌多重PCR鉴定方法，手册中提供的方法是适用于各种多杀

性巴氏杆菌的通用模板，许多方面描述不够具体。本文件引用了OIE推荐的特

异性引物，通过大量检测我国的巴氏杆菌分离株，不断对反应体系与反应条件进

行摸索与优化，使得该方法的适用性与操作性更强。本文件修订组人员用针对荚

膜分型的多重PCR方法对近年来分离和收集的328株Pm分离株进行鉴定，与

传统方法鉴定结果一致，表明我们依据OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准手册》

（2018版）建立的多重PCR方法适用于我国多杀性巴氏杆菌分离株的鉴定。通

过修订《牛出血性败血病诊断标准》（GB/T27530-2011）不仅能够快速对分离到

的巴氏杆菌进行分型，而且对控制牛巴氏杆菌病的疫情传播具有重要的指导意义。

通过对临床分离到的巴氏杆菌进行流行病学调查，不仅能够让兽医从业人员制定

合理的防疫计划与治疗计划，也能显著降低牛群发生其他疫病的风险。因此，通

过修订和颁布牛出血性败血症诊断技术标准，并进行普及和推广，能够大力推进

我国养牛业的发展。

本文件修订编制主要负责人李永清研究员是北京市奶牛产业技术创新体系

岗位专家，在岗位专家经费的资助下，其团队开展了以牛出血性败血病为主的流

行病学调查和研究。2016年6月，在国家重点研发计划项目“牛羊重要疫病诊断

与检测新技术研究”（项目编号：2016YFD0500900）的资助下，北京市农林科

学院畜牧兽医研究所、甘肃农业大学、中国动物卫生与流行病学中心和福建省农

业科学院畜牧兽医研究所联合开展“A、B群牛源多杀性巴氏杆菌鉴别诊断技术”

的研究。鉴于国内的疫情防治及相关技术比较成熟，拟修订国家标准《牛出血性

败血病诊断技术》（GB/T27530-2011），以进一步推动完善该疫病的标准化诊断。

本文件的修订过程中与国家标准《牛出血性败血病诊断标准》（GB/T27530-201

1）的第一编制起草人胡永浩教授进行多次交流，其给予了积极评价，并提供了

宝贵意见。

（二）标准修订单位及人员分工

本文件的编制由北京市农林科学院畜牧兽医研究所、甘肃农业大学、中国动

物卫生与流行病学中心和福建省农业科学院畜牧兽医研究所共同完成。标准修订

人为：李永清、宋翠平、胡永浩、秦立得、刘文晓、王玉东、赵思俊、傅光华、

黄瑜、曹旭敏、李木子、程龙飞、隋金钰、江波、段景龙、王晓茵、孙晓亮、王

淑婷、刘坤、徐福洲。标准起草人员的具体分工如下：

李永清：项目负责人，负责标准的立项、实施，主持该项目的方案设计研究、

具体实施以及标准的编制，负责编制说明的起草及相关技术文件的整理。

宋翠平：项目负责人，负责标准不同内容起草，负责标准的审阅，根据分工，

定期组织会议调整工作进度和工作方式。

胡永浩：项目负责人，负责标准的审阅、内容起草和方案设计。

秦立得：负责标准的审阅，定期组织会议调整工作进展。

刘文晓：负责PCR方法的建立及应用效果评价，负责标准内容与编制说明

书的起草。

段景龙：负责基因分型PCR方法的建立。

江波：负责特异性、敏感性、重复性评价。

傅光华：负责Pm种和荚膜分群多重PCR的应用效果验证。

黄瑜：负责标准在部分地区基层兽医站的宣贯及推广应用。

程龙飞：负责Pm基因型多重PCR应用效果评价。

刘文晓：负责临床样品检测、标准验证。

王玉东：负责PCR应用效果评价和临床样品检测。

赵思俊：负责PCR应用效果评价和临床样品检测。

曹旭敏：负责临床样品检测、标准验证。

李木子：负责临床样品检测、标准验证。

隋金钰：负责临床样品检测、标准验证。

王晓茵：负责临床样品检测、标准验证。

孙晓亮：负责临床样品检测、标准验证。

王淑婷：负责临床样品检测、标准验证。

刘坤：负责临床样品检测、标准验证。

徐福洲：参与审订和修改。

（三）主要工作过程

1、起草阶段

2016年6月，在国家重点研发计划项目“牛羊重要疫病诊断与检测新技术研

究”（项目编号：2016YFD0500900）的资助下，北京市农林科学院畜牧兽医研

究所、中国动物卫生与流行病学中心和福建省农业科学院畜牧兽医研究所联合开

展“A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌鉴别诊断技术”的研究。2017年11月，是文

件起草阶段。项目负责人组织各成员成立了《多杀性巴氏杆菌多重PCR分型鉴

定技术》国家标准的起草小组，按照项目任务要求，商议制定了具体实施计划及

任务要求，明确了人员分工及工作进度，启动了标准文件编制工作。首先起草小

组组织成员查阅大量的技术资料，包括GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1

部分：标准的结构和编写》的要求等；世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物卫

生法典》、《陆生动物诊断和疫苗手册》等；国内相关技术标准、规范、法律、法

规等，包括《牛出血性败血病诊断技术》（GB/T27530-2011）以及国内外已发表

的关于Pm病原学及诊断技术相关研究进展的文章、专利等资料。

起草小组通过对上述材料进行仔细研读及现有检测技术应用效果的比对分

析，并结合我国及国际上当前Pm的流行情况，商讨标准的定位、适用范围及基

本内容框架和应用技术方法，按要求和制定的方案开展标准起草工作，于2018

年8月完成了各自的撰写内容，于2018年8月28日形成了《多杀性巴氏杆菌多

重PCR分型鉴定技术》的起草小组讨论稿。最后经起草小组所在依托单位组织

本单位相关专家和技术人员对标准讨论稿的内容设置、技术可行性及相关附属材

料进行论证，并于2019年3月形成了上述技术文件。然而，通过咨询主管领导

及相关专家，得到的意见是：因为国家标准《牛出血性败血病诊断技术》（GB/

T27530-2011）已经规范了牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定技术标准，所以《牛源

多杀性巴氏杆菌多重PCR分型鉴定技术》就不应单独成为一个技术标准，但鉴

于原标准应用时间已近10年，有些内容已经不适合当前牛巴氏杆菌流行情况的

调查和诊断。于是，我们联系了甘肃农业大学的胡永浩教授进行了讨论。他的意

见是可以对上述国家标准通过增补多重PCR分型技术进行修订，以适应当前疫

苗免疫下鉴别检测的需要。2020年6月，我们在征询多方面专家意见后，完成

了《牛出血性败血病诊断技术》修订稿，然后又进行了反复修改和验证，最终形

成了该修订稿的征求意见稿。

2、征求意见阶段

2020年8月19日，起草小组将征求意见稿寄送21家单位21位专家。2

023年4月31日前，收到来自20家单位20名专家的回函。征求意见单位包括

中国农业大学、天津大学、河北农业大学、扬州大学、青岛农业大学、石河子大

学等6所大学；中国兽医药品监察所、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究

所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究、中国农业科学院兰州兽医研究所、新疆农

垦科学院等5家科研院所；北京市动物疫病预防控制中心、河北省动物疫病预防

控制中心以及广西壮族自治区动物疫病预防控制中心等3个动物疫控中心；北京

海关检验检疫技术中心、广州海关检验检疫技术中心、福州海关检验检疫技术中

心等3家出入境检验检疫相关单位以及北京三元集团畜牧兽医总站和新疆第八

师畜牧兽医工作站等2家基层兽医站，北京森康生物技术开发有限公司等1家诊

断制品生产企业。函评专家除1位专家未回函外，其余的都积极回复，均给予了

较高的评价，共征集到100条修改意见。

起草小组对征集的100条修改意见进行讨论与分析，并与相关专家进行了沟

通，依照标准编辑原则及疫病检测的技术特点，经标准起草小组商议后形成一致

意见，同意采纳其中的86条，占86%；未采纳9条，占9%；5条部分采纳，占

5%，对未采纳和部分采纳的意见一一向专家做出解答和说明，并得到专家的认

可。起草小组根据征集的专家修改意见，对文件的相应内容进行调整和修改，对

部分技术内容进行详细描述，并补充了相关附件材料，最后形成文件的送审稿。

二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据

（一）标准的编写原则

（1）规范性：本文件的结构和格式按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第

一部分：标准的结构和编写规则》要求进行编制。

（2）科学合理性：本文件的形成是在对多杀性巴氏杆菌(Pm)感染开展长期

调查、深入研究和分析的基础上，充分征求各方的意见，确保本文件可以作为

Pm分型鉴定及防控的良好依据。

（3）实用性：在对本文件临床宣贯和实施应用的基础上，依据牛源多杀性

巴氏杆菌的临床特征及病变特点，合理的、有针对性的设置标准内容，确保文件

内容具体、明确，具有可操作性，能切实提高检验检疫部门及养殖场对该病的诊

断能力，促进健康养殖、保障公共卫生安全。按照先进性和可操作性统一的原则，

既要保证本文件临床适用性，又要保证本文件操作实施的简便。

（二）提出本标准的依据

多杀性巴氏杆菌是引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，主要使动物发生出血

性败血症或传染性肺炎。该菌广泛存在于环境中，属于条件致病菌，能够在不同

或同种动物之间进行相互传染，也可以感染人（多因被动物咬伤所致）。相对于

其他细菌来说，巴氏杆菌的潜伏期比较长，难以发现。因此在牛巴氏杆菌的防治

过程中，需要定期对环境进行消毒，尽可能消除传染源。一旦发现牛巴氏杆菌的

感染，应立即采取应对措施。目前，我国采用牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗（主

要成分为灭活的荚膜B群多杀性巴氏杆菌）对荚膜B型菌具有良好的保护力，

但是只能对感染荚膜A型Pm的牛提供0%~30%保护。自2008年我国首次发现

牛源荚膜血清A型Pm感染以来，A型Pm成为我国牛巴氏杆菌病的主要流行菌

株，已在我国十多个省区发生并流行，给养牛业带来的经济损失高达数十亿元。

因此有必要建立一种能够快速鉴定A、B型的多重PCR方法，同时区分不同Pm

荚膜血清型（A/B/D/E/F）的多重PCR方法，以用于临床检测和流行病学调查。

我国目前已颁布的《牛出血性败血病诊断标准》（GB/T27530-2011）主要介

绍了流行特征、病理学诊断、病料采集以及病原鉴定，而病原鉴定只涉及了生化

鉴定与血清学分型，缺少快速诊断方法，如核酸检测。另外，现行标准（GB/T

27530-2011）中病原分离与生化鉴定采用的培养基等试剂参考的国家标准《食品

卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂》（GB/T4789.28-2003）现在已经废止

了，需要进行更新。另外，过去工作人员进行病料采集时生物安全意识薄弱，缺

少生物安全处理措施，大大增加了疾病扩散的风险。总体而言，目前已有国家标

准采用的方法比较陈旧，就病原鉴定而言仅利用血清学试验进行分型，然而血清

学分型方法灵敏度与特异性都不高，无法为兽医从业人员提供快速、准确的诊断

结果，为我国养牛业发展提供比较系统的技术支持。

综上所述，根据我国国情，结合国内外巴氏杆菌研究的先进技术，制定一个

先进、实用、完整系统的巴氏杆菌检测技术标准，是养牛业发展的迫切需要。

（三）制定本标准的基础

制订本文件的主要承担单位北京市农林科学院畜牧兽医研究所是公益一类

事业编制的科研院所，成立于1958年。经历半个多世纪的发展历程，该研究所

积累了100余项科研成果。包括具有新兽药注册证书的23个畜禽用疫苗和诊断

试剂、95个国家发明专利及7个国家或行业标准；获得了国家技术发明奖二等

奖、北京市科学技术进步一等奖等多个奖励，发表了600多篇论文和专著，特别

是近5年以来，获得国家技术发明奖二等奖1项；农业部新兽药注册证书6个，

其中一类新兽药注册证书1个；制定或修订中华人民共和国农业行业标准2个，

即《鸡传染性鼻炎诊断技术》和《鸭坦布苏病毒病诊断技术》。

制订本文件的主要承担单位中国动物卫生与流行病学中心隶属于国家农业

农村部，规格正局（厅）级，是承担重大动物疫病流行病学调查，外来动物疫病

诊断、监测，动物和动物产品兽医卫生评估检测，动物卫生法规标准和重大外来

动物疫病防控技术措施研究等工作的国家级动物卫生机构，是国家实施兽医行业

管理的技术支撑单位。

开展本文件研究工作的实验室是“畜禽疫病防控技术”北京市重点实验室。实

验室现有建筑面积达2600平方米，设有II级负压生物安全室，100级正压细

胞制备室、8个实验操作单元以及2个洗涤和实验材料准备室；另外还有病理室

以及650平方米的SPF级实验动物房。实验室配备有多种先进的仪器设备如高

速冷冻离心机、超速冷冻离心机、流式细胞仪、基因芯片扫描仪、荧光倒置显微

镜、荧光PCR仪、凝胶成像分析系统、梯度PCR仪、细胞培养箱、生物安全

柜等，科研仪器设备价值近1600万元。目前本实验室正在按照CNAS-CL01进

行检测和校准能力认可。

在国家重点研发计划项目“牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究”（项目编

号：2016YFD0500900）以及北京市奶牛产业技术创新体系岗位专家工作经费的

资助下，北京市农林科学院畜牧兽医研究所首先进行了《北京及周边地区奶牛呼

吸性疾病流行情况的调研报告》；分离并收集了牛源多杀性巴氏杆菌；分别制备

A、B群牛多杀性巴氏杆菌的兔血清并进行了抗原优势菌株的筛选；完成了2株

A、B群牛多杀性巴氏杆菌转录组测序和分析比较。2018年底，本文件相关全部

的实验和验证工作已全部完成，相关成果发表研究论文2篇：两株牛源荚膜A

群脂多糖3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定.中国兽医杂志，2017，53（11）：39-42；

李宵阳，许健，刘文晓，章振华，徐福洲，陈小玲，李永清.牛源多杀性巴氏杆

菌主要荚膜群和脂多糖基因型两组三重PCR检测方法.中国动物检疫,2022,39

（1）:97-104。

授权国家发明专利：一种鉴别A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量

RT-PCR方法，专利号为：ZL201811332791.2，授权日期2022年3月25。

（四）实验内容

1.购自中国兽医药品监察所的5株菌株作为本文件试验用的多杀性巴氏杆

菌A、B、D、E、F群的代表菌株，结合本实验室分离鉴定的菌株，参考文献中

的反应体系和反应条件，建立并优化了检测巴氏杆菌5种荚膜血清群的多重PCR

方法。

2.制作盲样寄送国内相关专业实验室，验证Pm种和荚膜分群多重PCR的

应用效果，用该方法对菌株进行基因型测定并统计结果。

3.临床试验：采集奶牛场的疑似病牛鼻拭子，使用上述多重PCR方法进行

Pm检测和分型鉴定。

（五）实际应用效果

1．利用本文件的方法对本实验室保存的115株A型和56株B型牛源Pm

实施鉴定并与常规的血清学分型和透明质酸抑制试验进行比对。结果表明，170

株菌的检测结果完全符合，即符合率为99.42%；结果不相符的菌株为从中国兽

医微生物菌种保藏管理中心购买的菌株CVCC406,虽然透明质酸抑制试验鉴定

为B型，但依据本文件和OIE推荐的技术均鉴定为A型。

2．提取本实验室保存的PmA型与B型菌株的基因组DNA分别进行10倍

稀释，从1ng/μL稀释至100fg/μL，结果表明，本文件的方法最低检测限为

10~100pgDNA。将细菌培养液进行10倍稀释，从106CFU/μL稀释至102CFU/μL，

本文件的方法最低检测限为104CFU/μL。

3．利用本文件的方法检测10种牛源相关致病细菌、环境中常见细菌与Pm，

结果表明只有Pm能够检测到特异性条带，牛源相关致病细菌与环境中常见的细

菌均不能检测到PCR条带。

4．利用本文件的方法重复5次检测PmA型、B型、D型、E型、F型菌株

与金黄色葡萄球菌，Pm菌株均能检测到特异性条带，金黄色葡萄球菌均没有条

带。

5．利用本文件的方法和OIE2018版推荐的技术，分别对从北京、河北奶牛

场采集的328份疑似牛多杀性巴氏杆菌感染的病牛鼻气管分泌物进行检测，结果

发现，所检样品中45份为A型、6份为B型Pm、24份为F型，阳性率为22.86%，

两种检测方法的符合率为100%。

6．对本实验室近年保存的21株D、E型Pm分离株分别用本文件建立的荚

膜分型方法与血清学分型试验进行分型，结果显示其中D型16株，E型5株，

两种方法的符合率为100%。

通过上述试验表明，本方法具有敏感性好、特异性强及重复性好的特点，将

填补国内多杀性巴氏杆菌病检测与鉴别方法的空白，为我国牛多杀性巴氏杆菌病

的防控及扑灭提供依据。

三、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的

经济效果

（一）主要试验或验证的分析

临床上流行的Pm血清群、血清型及基因型众多，为能对该病进行快速、准

确检测，多重PCR是一种最适用的分子生物学诊断、分型技术。

1、选择或设计PCR引物

1998年，Townsend等首先针对多杀性巴氏杆菌种的特异性基因设计了一对

特异性引物，随后Townsend等（2001）又根据Pm不同血清型的荚膜合成基因：

hyaD（A型）、bcbD（B型）、dcbF（D型）、ecbJ（E型）及fcbD（F型）五个

群特异性基因分别设计其特异性引物，并建立了荚膜分型多重PCR。该方法20

04年前已被OIE写入牛出血性败血症(HS）诊断方法，该方法可快速有效地鉴定

Pm种及其血清型，因而国内外很多实验室已用该方法取代了传统血清学荚膜分

型方法。本文件修订小组成员结合国外研究进展及成熟方法，设计并筛选了Pm

种特异性引物和荚膜分型的特异性引物，建立鉴定Pm种和5种荚膜血清型的多

重PCR。

扩增引物：

引物目的基因引物名引物序列（5’-3’）产物

特异性或基因座（bp）

所有PmKMT1KMT1T7ATCCGCTATTTACCCAGTGG384

KMT1SP6GCTGTAAACGAACTCGCCAC

荚膜A型hyaD-hyaCCAPA-FCCAAAATCGCAGTCAGTA564

CAPA-RGTTGCCATCATTGTCAGT

荚膜B型bcbDCAPB-FTGCCAAAATCGCAGTCAG760

CAPB-RTTGCCATCATTGTCAGTG

荚膜D型dcbFCAPD-FTTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC657

CAPD-RCATCTACCCACTCAACCATATCAG

荚膜E型ecbJCAPE-FTCCGCAGAAAATTATTGACTC511

CAPE-RGCTTGCTGCTTGATTTTGTC

荚膜F型fcbDCAPF-FAATCGGAGAACGCAGAAATCAG851

CAPF-RTTCCGCCGTCAATTACTCTG

2、优化PCR条件（请补充优化好的PCR反应条件及反应体系）

按常规方法，以阳性对照为模板，优化了2种多重PCR的引物浓度、PCR

试剂浓度、反应体系，以及PCR反应的退火温度、循环参数等程序。通过比较

不同反应条件的扩增结果，最终确定Pm荚膜分型检测的PCR反应总体系为25

μL：2mmol/L的dNTPs5µL、10×PCRbuffer2.5µL、TaqDNA聚合酶0.25µL

（5U/µL）、Pm种鉴定特异性引物（KMT1T7、KMT1SP6）各1µL（20µmol/L）、

Pm荚膜分型特异性引物（F、R）各1µL（20µmol/L）；样品DNA或阴性对照、

阳性对照DNA1µL，灭菌水补足到25µL。每次试验设阳性对照和阴性对照（阴

性对照可用水或非PmDNA为模板）。PCR反应程序为94℃3min预变性；然

后进行30个循环的扩增（94℃变性30s,52退火℃30s,72℃延伸1min）；最后

72℃延伸10min，4℃保存（见图1）。

图1.A、B、D、E、F型巴氏杆菌荚膜分型PCR反应的扩增条件优化

在应用过程中，也可采用商品化的PCR扩增试剂盒，包括Taq酶和PCR

Mix，在内参基因Pm种鉴定特异性引物能扩增出来的情况，如果分型引物的条

带较弱，可以通过去除Pm种鉴定引物的方法改善扩增结果。

通过检测纯化DNA、煮沸DNA、菌落和液体培养物等多种阳性DNA模板，

证实本文件的方法切实可行（见图2）。

图2.比较不同类型的PCR扩增模板

3、检验PCR的特异性和敏感性

以10种牛源相关致病细菌（牛化脓性隐秘杆菌、牛停乳链球菌、牛表皮葡

萄球菌、牛肠炎沙门氏菌、牛大肠杆菌、牛金黄色葡萄球菌、牛粪链球菌、牛有

色葡萄球菌、牛短芽孢杆菌及牛无乳链球菌）、环境中常见细菌（包括枯草芽孢

杆菌、变形杆菌、纳豆杆菌、弯曲杆菌、鸡大肠杆菌）与Pm的基因组提取物为

模板采用本研究建立的多重PCR方法进行检测，验证了其该方法的特异性，结

果显示该方法仅与Pm反应，对其它细菌检测呈阴性。

用已知血清型Pm的纯化DNA和培养液为模板，检验了多重PCR的敏感性。

Pm种群PCR方法的检测限为10~100pgDNA或200~2000CFU（见图3）。

图3.灵敏度评价

4、多重PCR临床验证

利用本文件的方法和OIE推荐方法同时对从北京、河北、安徽、宁夏等地牛

场采集的328份疑似牛多杀性巴氏杆菌感染的病牛鼻气管分泌物进行检测，结果

表明，所检样品中45份为A型，6份为B型Pm，24份为F型Pm，阳性率为

22.86%，2种检测方法的符合率为100%。

（二）预期的经济效果

牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，Pm）感染是牛出血性败血病

以及纤维素性出血性肺炎的病原，其血清型及基因型众多，且相互间抗原性差异

很大，被OIE定为二类传染病。该病对我国养牛业（包括肉牛和奶牛）的危害

极其严重，2008年以来牛出血性败血症已在我国十余省区发生与流行，给养牛

业带来的经济损失高达数十亿元。

因此快速准确地鉴定Pm的血清型是防控牛出血性败血病的关键。传统的P

m荚膜分型方法主要包括间接血凝（IHA）或凝胶扩散（GD）方法、脂多糖分

型主要用凝胶扩散（GD）方法等，但这些方法存在耗时长、操作繁琐、成本高、

准确性低和重复性差等缺点，甚至有菌株不可分型或有交叉反应。PCR方法具

有特异性强、灵敏度高、操作简便、耗时短等优点，可用于对Pm进行快速的鉴

别与分型。

本文件增补了多杀性巴氏杆菌荚膜分型的多重PCR鉴定方法，提高了巴氏

杆菌病的病原诊断和分型鉴定效率，可用于临床快速诊断、流行病学调查、疫苗

株筛选等，对牛出血性败血病的防控及净化将起到推进作用。本文件修订的理论

基础充分，针对性、实用性、可操作性强。更加完善和先进的标准通过长期大面

积应用的检验，可在全国推广应用。

四、采用国际标准和国外先进标准的程度

本文件对现行国家标准GB/T27530-2011中的病料采集与处理部分增加了生

物安全处理措施，参考了《中华人民共和国动物防疫法》。本文件中增加的巴氏

杆菌荚膜分型鉴定的多重PCR方法制定参考了OIE《陆生动物诊断试验与疫苗

手册2018版第3.4.10章》推荐的技术方法，以及Townsend等（2001）和Harper

等（2015）报道的方法。OIE手册推荐的方法是适用于各地区巴氏杆菌鉴定的通

用模板，许多方面描述不够具体。修订小组根据我国Pm分离株的特点，通过多

次试验验证对反应体系与反应条件进行规范化与具体化，使其适用性与可操作性

更强。

五、与现行的法律、法规和强制性国家标准的关系

本文件系统的规定了牛出血性败血症的诊断技术标准，具体内容遵循以下国

家标准或规范，具体说明如下：

１．病料的采集及处理符合《中华人民共和国动物防疫法》、《国家动物疫情

测报体系管理规范》、《动物检疫管理办法》、《动物疫病实验室检验采样方法》

（NY/T541）的相关规定；

２．病原学操作应符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生

物安全通用要求》（GB19489）的相关规定；

３．检测过程中使用的培养基与试剂应达到《实验动物细菌学检测染色法、

培养基和试剂》（GB/T14926.43-2001）的规定；水质应符合《分析实验室用水

规格和试验方法》（GB/T6682-2008）的标准。

六、重大分歧意见的处理经过和依据

无

七、标准性质（强制性，推荐性）的建议，特别是对建议批为强

制性标准的理由应充分说明

建议将本文件批为推荐性标准

八、贯彻标准的要求和建议措施（组织实施、技术措施、过渡办

法等）

为了标准有效贯彻实施，建议农业农村部兽医主管部门安排疫病研究及检测

相关单位，委托标准起草单位举办全国技术培训班，对有关技术人员进行相关技

术强化操作培训，培训效果要达到：懂原理、操作熟练、判定准确，回单位基本

能独立工作。

九、废止现行有关标准的建议；

无

十、其他应予说明的事项。无

一、工作简况

（一）修订和研究基础。

现行的牛出血性败血病诊断标准为国家标准《牛出血性败血病诊断技术》（G

B/T27530-2011），其针对牛出血性败血病的临床与病理学诊断以及病原的分离

与鉴定进行了技术规定。但是，现行的国家标准中的病原鉴定包括生化鉴定与血

清分型试验，操作起来比较繁琐，与核酸检测技术相比准确性与特异性不高，严

重制约了我国多杀性巴氏杆菌的流行病学调查和流行代表株的筛选，进一步阻碍

了新型疫苗的研发。因此对标准《牛出血性败血病诊断技术》进行修订，增加多

杀性巴氏杆菌多重PCR分型技术标准，以填补国内多杀性巴氏杆菌病检测的空

白，为我国牛多杀性巴氏杆菌病的防控及扑灭提供依据。

多杀性巴氏杆菌(P.multocida,Pm)是牛出血性败血症的病原，该病原在国内

养牛场的广泛流行，给养牛场造成重大的经济损失。2008年以前，引起牛出血

性败血症的主要是荚膜血清B群菌株。随着牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗（主

要成分为灭活的荚膜B群多杀性巴氏杆菌）的推广应用，近年来临床上分离到

的B群Pm菌株逐渐减少。现有资料表明，近10年来临床上分离到的荚膜血清

A型Pm逐渐增多，并有D、E、F型Pm分离株的报道。相对于其他细菌性疾病

来说，巴氏杆菌病的潜伏期比较长，因此，在巴氏杆菌病的预防控制工作中，应

尽可能消除巴氏杆菌的传染源。由于目前没有针对荚膜A型Pm的疫苗，而现有

的牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对A型菌株的交叉保护率低于30%，所以在养殖

过程中一旦发现其染上巴氏杆菌病，应立刻采取治疗措施。因此，分离菌株的分

型与鉴定是制定针对性的防治措施以及疫苗研发的基础。

现行国家标准（GB/T27530-2011）规定的分型方法包括间接血凝试验（IH

A）、琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、对流免疫电泳试验（CIEP）。传统的分型

方法比较繁琐，操作时间比较长，而且受试验材料限制可能出现无法分型的现象，

如间接血凝试验必须用具有凝集性的抗血清进行鉴定，若与所有血清都没有发生

凝集反应，则无法用该方法对菌株进行分型，而且IHA针对B型和E型菌更有

效；进行琼脂凝胶免疫扩散试验时所有能引起HS的血清型菌株均能与2型抗血

清反应，与5型抗血清也能发生交叉反应，从而出现误判。PCR技术具有快速、

准确、灵敏以及操作简便、灵活等特点，在临床检测上得到了广泛应用。2001

年澳大利亚学者建立了Pm种和5个荚膜血清型的6重PCR检测方法，该方法

检测效果良好并在全球得到推广和应用，而且已经被世界动物卫生组织（OIE）

采用用于巴氏杆菌的分型鉴定。目前世界各国学者在澳大利亚学者建立的方法基

础上，根据本国Pm的流行特点，优化并建立了适用于本国Pm流行病学调查的

PCR检测方法。2015年澳大利亚学者基于Pm的脂多糖（LPS）基因建立了基因

分型8重PCR，2016年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在其基础上改进并建

立了一种LPS-mPCR。本文件的修订参考了OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准

手册》中的多杀杆菌多重PCR鉴定方法，手册中提供的方法是适用于各种多杀

性巴氏杆菌的通用模板，许多方面描述不够具体。本文件引用了OIE推荐的特

异性引物，通过大量检测我国的巴氏杆菌分离株，不断对反应体系与反应条件进

行摸索与优化，使得该方法的适用性与操作性更强。本文件修订组人员用针对荚

膜分型的多重PCR方法对近年来分离和收集的328株Pm分离株进行鉴定，与

传统方法鉴定结果一致，表明我们依据OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准手册》

（2018版）建立的多重PCR方法适用于我国多杀性巴氏杆菌分离株的鉴定。通

过修订《牛出血性败血病诊断标准》（GB/T27530-2011）不仅能够快速对分离到

的巴氏杆菌进行分型，而且对控制牛巴氏杆菌病的疫情传播具有重要的指导意义。

通过对临床分离到的巴氏杆菌进行流行病学调查，不仅能够让兽医从业人员制定

合理的防疫计划与治疗计划，也能显著降低牛群发生其他疫病的风险。因此，通

过修订和颁布牛出血性败血症诊断技术标准，并进行普及和推广，能够大力推进

我国养牛业的发展。

本文件修订编制主要负责人李永清研究员是北京市奶牛产业技术创新体系

岗位专家，在岗位专家经费的资助下，其团队开展了以牛出血性败血病为主的流

行病学调查和研究。2016年6月，在国家重点研发计划项目“牛羊重要疫病诊断

与检测新技术研究”（项目编号：2016YFD0500900）的资助下，北京市农林科

学院畜牧兽医研究所、甘肃农业大学、中国动物卫生与流行病学中心和福建省农

业科学院畜牧兽医研究所联合开展“A、B群牛源多杀性巴氏杆菌鉴别诊断技术”

的研究。鉴于国内的疫情防治及相关技术比较成熟，拟修订国家标准《牛出血性

败血病诊断技术》（GB/T27530-2011），以进一步推动完善该疫病的标准化诊断。

本文件的修订过程中与国家标准《牛出血性败血病诊断标准》（GB/T27530-201

1）的第一编制起草人胡永浩教授进行多次交流，其给予了积极评价，并提供了

宝贵意见。

（二）标准修订单位及人员分工

本文件的编制由北京市农林科学院畜牧兽医研究所、甘肃农业大学、中国动

物卫生与流行病学中心和福建省农业科学院畜牧兽医研究所共同完成。标准修订

人为：李永清、宋翠平、胡永浩、秦立得、刘文晓、王玉东、赵思俊、傅光华、

黄瑜、曹旭敏、李木子、程龙飞、隋金钰、江波、段景龙、王晓茵、孙晓亮、王

淑婷、刘坤、徐福洲。标准起草人员的具体分工如下：

李永清：项目负责人，负责标准的立项、实施，主持该项目的方案设计研究、

具体实施以及标准的编制，负责编制说明的起草及相关技术文件的整理。

宋翠平：项目负责人，负责标准不同内容起草，负责标准的审阅，根据分工，

定期组织会议调整工作进度和工作方式。

胡永浩：项目负责人，负责标准的审阅、内容起草和方案设计。

秦立得：负责标准的审阅，定期组织会议调整工作进展。

刘文晓：负责PCR方法的建立及应用效果评价，负责标准内容与编制说明

书的起草。

段景龙：负责基因分型PCR方法的建立。

江波：负责特异性、敏感性、重复性评价。

傅光华：负责Pm种和荚膜分群多重PCR的应用效果验证。

黄瑜：负责标准在部分地区基层兽医站的宣贯及推广应用。

程龙飞：负责Pm基因型多重PCR应用效果评价。

刘文晓：负责临床样品检测、标准验证。

王玉东：负责PCR应用效果评价和临床样品检测。

赵思俊：负责PCR应用效果评价和临床样品检测。

曹旭敏：负责临床样品检测、标准验证。

李木子：负责临床样品检测、标准验证。

隋金钰：负责临床样品检测、标准验证。

王晓茵：负责临床样品检测、标准验证。

孙晓亮：负责临床样品检测、标准验证。

王淑婷：负责临床样品检测、标准验证。

刘坤：负责临床样品检测、标准验证。

徐福洲：参与审订和修改。

（三）主要工作过程

1、起草阶段

2016年6月，在国家重点研发计划项目“牛羊重要疫病诊断与检测新技术研

究”（项目编号：2016YFD0500900）的资助下，北京市农林科学院畜牧兽医研

究所、中国动物卫生与流行病学中心和福建省农业科学院畜牧兽医